Палочковидные:

• фирмикуты, служащие источником сибирской язвы и токсических инфекций;

• клостридии, как возбудители столбняка и ботулизма;

• листерия, заражение которой приводит к воспалению мозга.

Булавовидные:

• коринебактерии, вызывающие дифтерию.

Грамотрицательные бактерии, более устойчивые к антителам за счет дополнительной мембраны, представлены такими разновидностями:

1. Спиралевидные:

• спирохеты, которые являются возбудителями лептоспироза, возвратного тифа и сифилиса;

• спириллы, вызывающие содоку – лихорадкоподобное состояние.

Палочки:

• риккетсии, чей главной характеристикой служит внутриклеточный паразитизм;

• хламидии – без лечения могут развиться ЗППП, конъюнктивит, пневмония.

34. Искусственные питательные среды. Классификация, состав основных питательных сред для выращивания разных видов микроорганизмов. Примеры.

Среды разделяются на естественные и искусственные. Как естественные используют свернутую сыворотку, молоко, яйца, мышечную ткань. Искусственные среды создают путем комбинирования разнообразных субстратов, которые обеспечивают те или другие потребности микроорганизмов. Их используют в основном для экспериментального изучения отдельных звеньев метаболизма бактерий.

По происхождению питательные среды можно разделить на натуральные, синтетические, полусинтетические.

Натуральными обычно называются среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения, имеющие неопределенный химический состав. Основой таких сред являются злаки, травы, овощи, фрукты, молоко, животные ткани, кровь, сыворотка, мясо, почва, вода морей, озер и минеральных источников, яйца, шерсть, дрожжи. Большинство из них используется в виде экстрактов, отваров, настоев. Примеры таких сред – мясо-пептонный бульон (МПБ) для гетеротрофов, неохмеленное пивное сусло для дрожжей, почвенная выдержка для почвенных микроорганизмов. Натуральные среды используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и для диагностических целей.

Компонентами полусинтетических сред наряду с соединениями известного состава (углеводы, фосфаты, нитраты и др.) являются натуральные продукты неопределенного состава (мясной отвар, пивное сусло). Такие среды находят широкое применение в промышленной микробиологии.

Синтетические среды – это такие среды, в состав которых входят только определенные, химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Эти среды готовят только на дистиллированной воде. Синтетические среды наиболее удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов.

В последние годы в целях экономии питательных сред и ускоренной идентификации некоторых микроорганизмов (энтеробактерии, стафилококки, стрептококки и др.) применяются так называемые микротест-системы (МТС). Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых содержатся стерильные дифференциально-диагностические среды. Стерилизацию МТС проводят УФ-облучением. Микротест-системы особенно удобны при массовых бактериологических исследованиях в практических лабораториях. По назначению среды делят на:

1. Универсальные (МПА, МПБ и др.). На них растут многие микроорганизмы.

2. Специальные. Эти среды применяют для выращивания бактерий, не размножающихся на универсальных средах. Среди специальных сред различают элективные и дифференциально-диагностические. Элективные (избирательные) среды подобраны таким образом, чтобы обеспечить наиболее благоприятные условия для выращивания определенных микроорганизмов. Их применяют для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания или для получения накопительных культур. К таким средам относятся среда Эшби для Azotobacter, среда Виноградского для Clostridium. Дифференциально-диагностические среды используют для дифференциации определенных видов бактерий по их культуральным и биохимическим свойствам. К таким средам относят среды с молоком, желатином, на которых определяют протеолитические свойства микробов. В состав дефференциально-диагностических сред могут входить индикаторы (феноловый красный, метиленовый синий и т.д.), которые, изменяя окраску при различных значениях рН, указывают на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления вводимого в среду субстрата. Примером таких сред является среда Эндо, применяемая для выделения и определения бактерий кишечной группы, на которой колонии кишечной палочки окрашиваются в красный цвет с металлическим блеском.

По физическому состоянию среды разделяются на жидкие, плотные, сыпучие. Для выяснения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, а также для накопления их биомассы или продуктов обмена наиболее удобно применять жидкие среды. Плотные среды используют для выделения чистых культур, в диагностических целях, для хранения и количественного учета микроорганизмов и в ряде других случаев. Для уплотнения сред применяют агар-агар, желатин и кремнекислый гель.

Агар-агар – сложный полисахарид, получаемый из бурых водорослей, который образует гель с точкой плавления 96-100°С и температурой застывания 40°С. Плотные питательные среды получают, добавляя к жидким 1.5-2% агар-агара.

Желатин – вещество белковой природы, которое получают из костей и хрящей животных при их вываривании. Его добавляют к средам в количестве 10-20%. Образуемый желатином гель плавится при 23-25°С и застывает при 20°С, а также разжижается под действием протеолитических ферментов многих микроорганизмов, в связи с чем используется ограниченно.

Кремнекислый гель (силикагель) образуется из силикатов калия или натрия и соляной кислоты. Хорошо промытые и стерильные гелевые пластинки в чашках Петри пропитывают стерильной питательной средой. Преимуществом силикагеля является то, что он представляет собой минеральное соединение и пригоден для культивирования автотрофов (например, нитрифицирующих бактерий).

Приготовление питательных сред. Подготовленные навески ингредиентов помещают в стеклянную колбу или кастрюлю, доливают требуемое количество бульона или дистиллированной воды, кипятят на электрической плитке до растворения всех компонентов, устанавливают необходимое значение рН: сначала с помощью индикаторной бумажки, а затем потенциометра.

Фильтрование. Жидкие питательные среды фильтруют через двойной складчатый фильтр из фильтровальной бумаги, предварительно смоченной водой, или через фильтровальное полотно, которое накладывают на стеклянную воронку. Полотняные фильтры значительно практичнее бумажных, так как годны к употреблению в течение длительного времени, в то время как бумажные фильтры употребляются лишь однократно. Рекомендуется иметь отдельные полотняные фильтры для каждого вида среды.

Агаровые среды в расплавленном состоянии лучше всего фильтруются через ватно-марлевый фильтр: стеклянную воронку покрывают марлевой салфеткой такого размера, чтобы концы салфетки были перекинуты через края воронки наружу; затем на марлю кладут слой гигроскопической ваты, фильтр смачивают горячей дистиллированной водой. Агар наливают на фильтр горячим.

Желатиновую среду фильтруют через бумажный фильтр, предварительно смоченный дистиллированной водой. Желательно фильтрацию производить быстро в теплом помещении.

Розлив сред. После осветления и фильтрации питательные среды разливают в колбы, флаконы, пробирки, бутыли или матрацы. Питательные среды закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх ватно-марлевой пробки на колбы и флаконы с питательными средами надевают бумажные колпачки. Для разливки жидких питательных сред пользуются одной из описанных ниже установок.

При розливе сред края посуды нельзя смачивать питательной средой, так как ватно-марлевые пробки, приклеиваясь к стеклу во время стерилизации, вынимаются с трудом и оставляют в просвете отверстия сосуда остатки ваты. Попадая в среду, они могут вызывать загрязнение ее посторонней микрофлорой.

Разливка плотных стерильных питательных сред в чашки Петри. Плотную питательную среду (агар, желатин) во флаконах или пробирках растапливают в водяной бане (сняв предварительно бумажные колпачки). Среду охлаждают до температуры 45-50°С, сосуд берут в правую руку, левой рукой над огнем вынимают пробку и держат ее между мизинцем и ладонью, а края флакона или пробирки обжигают. Открытую посуду со средой держат в наклонном положении, чтобы избежать попадания в среду микробов из воздуха. В асептических условиях вносят стерильную кровь, сыворотку или другие необходимые добавки, тщательно перемешивают содержимое сосуда. Левой рукой приподнимают с одной стороны крышку чашки Петри и выливают в нее питательную среду в количестве 15-20 мл, слегка покачивая чашку, чтобы среда распределялась равномерным слоем по ее поверхности.

В настоящее время ряд фирм изготовляют приборы-автоматы для разливки агаризованных сред в чашки Петри, обеспечивающие высокую стерильность и точное дозирование разливаемых сред.

При застудневании агара образуется большое количество конденсационной воды, которая оседает на внутренней стороне крышки и увлажняет поверхность среды. В связи с этим перед посевом среды подсушивают: чашку в открытом виде помещают в термостат таким образом, чтобы крышка служила опорой для края ее дна, перевернутого средой вниз. Чтобы избежать образования конденсированной влаги, чашки с расплавленным агаром тотчас после заливки накрывают листом фильтровальной бумаги, которую стерилизуют вместе с чашкой. Бумага не должна касаться поверхности среды. Когда среда окончательно остынет, фильтровальную бумагу снимают, а чашки закрывают крышками

35. Принципы культивирования микроорганизмов. Особенности культивирования строгих анаэробов.

Основные принципы культивирования микроорганизмов на питательных средах.

1.Использование всех необходимых для соответствующих микробов питательных компонентов.

2.Оптимальные температура, рН, rH₂, концентрация ионов, степень насыщения кислородом, газовый состав и давление.

Микроорганизмы культивируют на питательных средах при оптимальной температуре в термостатах, обеспечивающих условия инкубации.

 Выделение и культивирование строгих анаэробов и микроаэрофильных бактерий.

Метод Цейсслера применяется для выделения чистых культур спорообразующих анаэробов. Для этого производят посев на среду Китт-Тароцци, прогревают 20 мин при 80 °C (для уничтожения вегетативной формы), заливают среду вазелиновым маслом и инкубируют 24 ч в термостате. Затем производят посев на сахарно-кровяной агар для получения чистых культур. После 24-часового культивирования интересующие колонии изучаются — их пересеивают на среду Китт-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

 Метод Фортнера — посевы производят на чашку Петри с утолщенным слоем среды, разделённым пополам узкой канавкой, вырезанной в агаре. Одну половину засевают культуру аэробных бактерий, на другую — анаэробных. Края чашки заливают парафином и инкубируют в термостате. Первоначально наблюдают рост аэробной микрофлоры, а затем (после поглощения кислорода) — рост аэробной резко прекращается и начинается рост анаэробной.

Метод Вейнберга используется для получения чистых культур облигатных анаэробов. Культуры, выращенные на среде Китта-Тароцци, переносят в сахарный бульон. Затем одноразовой пастеровской пипеткой материал переносят в узкие пробирки с сахарным мясо-пептонным агаром, погружая пипетку до дна пробирки. Засеянные пробирки быстро охлаждают, что позволяет фиксировать бактериальный материал в толще затвердевшего агара. Пробирки инкубируют в термостате, а затем изучают выросшие колонии. При обнаружении интересующей колонии на её месте делают распил, материал быстро отбирают и засеивают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

36. Культуральные свойства микроорганизмов.

Культуральные свойства микроорганизмов определяют посевом их на жидкие, полужидкие и плотные среды. На жидких средах учитывают степень и характер помутнения бульона, величину, форму и консистенцию осадка, наличие или отсутствие плёнки на поверхности среды, размер и форму пристеночного кольца. На полужидких средах определяют рост по уколу, на плотных — форму, размер, величину, цвет колоний и густоту роста. На форму и величину колоний оказывают влияние состав питательной среды, а также культуральная изменчивость микроорганизмов. Морфологию микробов изучают путём микроскопии мазков из патол. материала и из культур, окрашенных по Граму, и др. методами. Обращают внимание на размер, форму (кокки, палочки, извитые), расположение (одиночно, цепочками, попарно, гроздьями), наличие спор и капсул, включений, жгутиков. Определяют подвижность (исследование культур в висячей капле или посев на полужидкую среду). Биохимич. активность и метаболизм микроорганизмов изучают на дифференциально диагностических средах. Определяют способность бактерий расщеплять белки, жиры и углеводы, редуцировать органич. краски, восстанавливать нитраты в нитриты и нитриты в аммиак, выделять ферменты. Одновременно определяют отношение микробов к кислороду и углекислоте, а также их гемолитич. активность. Антигенную структуру изучают при помощи различных серологич. реакций (агглютинации, преципитации, связывания комплемента, иммунофлюоресценции, иммуноэлектрофореза и др.). Используют также методфаготипирования, определение способности продуцировать бактериоцины.

37. Биохимические (ферментативные) свойства микроорганизмов.

Бактерии синтезируют разнообразные ферменты, принадлежащие к 6 классам. Ферментный состав любого микроба определяется его геномом и является довольно стабильным признаком. Поэтому определение сахаролитических. протеолитических и других ферментов, образуемых определенными видами и даже вариантами (биоварами) бактерий имеют важное таксономическое значение, широко применяясь для ах систематики и идентификации. Целый ряд ферментов (гиалуронидаза, коагулаза и др.) способствуют проявлению патогенных свойств возбудителей, поскольку субстратом их действия являются вещества, входящие в состав клеток и тканей организма человека.

Одни ферменты локализуются в цитоплазме, цитоплазматической мембране и периплазматическом пространстве бактерий - эндоферменты, другие - экзоферменты, выделяются в окружающую среду. Функциональное значение экзоферментов связано с расщеплением макромолекул в окружающей среде до более простых соединений.

Ферменты могут функционировать независимо друг от друга или быть тесно связанными между собой, обеспечивая протекание метаболических реакций в строгой последовательности. Последние носят название - мультиферментные комплексы (ферменты дыхательной цепи, локализованные на цитоплазматической мембране).

У бактерий различают три основные группы ферментов:

1. Конститутивные - постоянно синтезирующиеся в микробных клетках.

2. Индуцибелъные - синтез которых индуцируется соответствующим субстратом.

3. Репрессибельные - синтез которых подавляется в результате избыточного накопления продукта реакции, катализируемой данным ферментом.

Для идентификации микроорганизмов - возбудителей инфекционных болезней, кроме морфологических и культурных свойств, необходимо изучение биохимических признаков, к которым относят: сахаролитические, протеолитические свойства бактерий, пигменто- и токсинообразование.

Бактерии характеризуются неодинаковой способностью использовать различные углеводы. Утилизация углеводов бактериями приводит к образованию органических кислот, либо кислот и газов.

Определение сахаролитических ферментов проводит на средах Гисса. состоящих из 1% пептонной воды. 0.5% определенного углевода (глюкоза, лактоза, маннит и др.) и индикатора Андреде (кислый фуксин в 1н. растворе NаОН). В пробирку со средой опускают поплавок (стеклянная трубочка один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов. Свежеприготовленная среда имеет соломенно-желтый цвет Результаты посевов учитываются через 24-48 часов. О разложении углеводов судят по изменению цвета среды (она приобретает красный цвет, в результате сдвига рН в кислую сторону). О газообразовании свидетельствует накопление газа в поплавке.

Отдельные бактерии продуцируют и выделяют во внешнюю среду протеолитические ферменты - протеазы, катализирующие расщепление белка

Для определения протеолитических ферментов - коллагеназ производят посев уколом исследуемой культуры в столбик мясо-пептонной желатины (МПЖ). Продолжительность культивирования 7-10 суток при комнатной температуре. При положительном результате наблюдается разжижение желатины. Например: возбудитель сибирской язвы образует кратерообразное разжижение МПЖ.

На практике о протеолитической активности бактерий чаще судят по способности расщеплять белок до продуктов глубокого распада: индола и сероводорода. Для этого исследуемую культуры засевают на МПБ. между пробкой и горлышком пробирки укрепляют индикаторные бумажки. На сероводород - индикаторная бумажка пропитана уксуснокислым свинцом (при выделении Н_:8 - она чернеет), а на индол - индикаторная бумага пропитана раствором щавелевой кислоты (при выделении индола - она краснеет).

В настоящее время для изучения биохимических свойств бактерий используется система индикаторная бумажная (СИБ) или мультимикротссты (ММТ).’

СИБ - набор бумажных дисков, пропитанных различными субстратами и индикаторами, которые помещают в пробирки с взвесью изучаемой культуры. ММТ - представляют собой пластиковые планшеты, в лунках которых находятся различные субстраты с индикаторами, на которые наносится взвесь изучаемой культуры. После суточного инкубирования в термостате по изменению цвета индикаторных дисков (при использовании СИБ) или содержимого лунок (при использовании ММТ) судят о биохимических свойствах культуры.

Пигментообразование является стойким генетическим признаком микроба и его цвет используется для идентификации пигментообразующих бактерий. Для большинства патогенных бактерий пигментообразование не характерно. Белый, золотистый, лимонно-желтый пигмент образуют стафилококки; желтый, кремовый - микобактерии туберкулеза; рубиново-красный – серрации; сине- зеленый - синегнойная палочка.

Пигменты, как правило, защищают микробную клетку от ультрафиолетовой радиации.

38. Выделение чистой культуры микроорганизмов.

Чистой культурой называют такую культуру, которая содержит микроорганизмы одного вида. Выделение чистых культур бактерий - обязательный этап бактериологического исследования в лабораторной диагностике инфекционных болезней, в изучении микробной загрязненности различных объектов окружающей среды, и, в целом, при любой работе с микроорганизмами. Исследуемый материал (гной, мокрота, фекалии, кровь и другой материал от больных; вода, почва, воздух, пищевые продукты, трупы животных и человека, переносчики) обычно содержит ассоциации микробов. Выделение чистой культуры позволяет изучить морфологические, культуральные , биохимические, антигенные и другие признаки, по совокупности которых определяется видовая и типовая принадлежность возбудителя, то есть производится его идентификация. Для выделения чистых культур микроорганизмов используют методы, которые можно разделить на несколько групп.

    * Метод Пастера - последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде до концентрации одной клетки в объеме (имеет историческое значение).     * Метод Коха («пластинчатые разводки») - последовательное разведение исследуемого материала в расплавленном агаре (температура 48-50 ° С), с последующим разливом в чашки Петри, где агар застывает. Высевы делают, как правило, из трех-четырех последних разведений, где бактерий становится мало и, в дальнейшем, при росте на чашках Петри появляются изолированные колонии, образующиеся из одной исходной материнской клетки. Из изолированных колоний в глубине агара получают чистую культуру бактерий пересевом на свежие среды.     * Метод Шукевича - применяется для получения чистой культуры протея и других микроорганизмов обладающих «ползущим» ростом. Посев исследуемого материала производят в конденсационную воду у основания скошенного агара . Подвижные микробы (протей) способны подниматься вверх по скошенному агару , неподвижные формы остаются расти внизу на месте посева. Пересевая верхние края культуры можно получить чистую культуру.     * Метод Дригальского - широко применяется в бактериологической практике, при этом исследуемый материал разводят в пробирке стерильным физиологическим раствором или бульоном. Одну каплю материала вносят в первую чашку и стерильным стеклянным шпателем распределяют по поверхности среды. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой же посев во второй и третьей чашках. С каждым посевом бактерий на шпателе остается все меньше и меньше и, при посеве на третью чашку, бактерии будут распределяться по поверхности питательной среды отдельно друг от друга. Через 1-7 сут выдерживания чашек в термостате (в зависимости от скорости роста микроорганизмов) на третьей чашке каждая бактерия дает клон клеток, образуя изолированную колонию, которую пересевают на скошенный агар с целью накопления чистой культуры.     * Метод Вейнберга . Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов. Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев производят по методу Дригальского , но после этого чашки сразу помещают в анаэростат . Однако чаще пользуются методом разведения. Сущность его заключается в том, что разведения исследуемого материала проводят в расплавленной и охлажденной до 45-50 ° С агаризированной питательной среде. Делают 6-10 последовательных разведений, затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем смеси парафина и вазелинового масла, чтобы помешать проникновению воздуха в толщу питательной среды. Иногда питательную среду после посева и перемешивания переносят в стерильные трубки Бурри или капиллярные пипетки Пастера, концы которых запаивают. При удачном разведении в пробирках, трубках Бурри , пипетках Пастера вырастают изолированные колонии анаэробов. Чтобы изолированные колонии хорошо были видны, используют осветленные питательные среды. Для извлечения изолированных колоний анаэробов, пробирку слегка нагревают, вращая ее над пламенем, при этом агар , прилегающий к стенкам, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара разрезают стерильным пинцетом и извлекают колонии петлей. Извлеченные колонии помещают в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов (например, среду Китта-Тароцци ). Агаризированную среду из трубки Бурри выдувают, пропуская газ через ватную пробку.     * Метод Хангейта - когда хотят получить изолированные колонии бактерий с особенно высокой чувствительностью к кислороду (ст рогие аэробы) используют метод вращающихся пробирок Хангейта . Для этого расплавленную агаризированную среду засевают бактериями при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку, среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя в пробирке, заполненной газовой смесью, позволяет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом.     * Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора . Микроманипулятор - прибор, позволяющий с помощью специальной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. На предметном столике микроскопа устанавливают влажную камеру, в которую помещают препарат «висячая капля». В держателях операционных штативов закрепляют микропипетки ( микропетли ), перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов. Исследователь, глядя в микроскоп, извлекает отдельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой для получения клона клеток.

39. Этапы индикации и идентификации микроорганизмов.

1 Этап. Выделение.

Фильтрация исследуемого материала через бактериальные фильтры, нагревание до 75°С и /или обработка хлороформом с целью устранения сопутствующей микрофлоры.

2 Этап. Индикация и идентификация.

2.1 Метод фишера

Фаг наносится на поверхность засеянной на МПА культуры микроорганизм

2.2 Метод фюрта

Фаг вносится в расплавленный и остуженный агар, на который штрихом засевают культуры микроорганизмов

2.3Метод «стекающей капли»

по Отто

На чашку с МПА засевают газоном кишечную палочку и пипеткой наносят исследуемый фильтрат. Инкубация в термостате.

3 Этап. Титрование

Титриметрический анализ (титрование) — метод количественного/массового анализа, который часто используется в аналитической химии, основанный на измерении объёма раствора реактива точно известной концентрации, расходуемого для реакции с определяемым веществом.

40. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

Для определения чувствительности микробов к антибиотикам существуют различные методы, среди которых наиболее распространены методы диффузии в агар (метод дисков) и метод последовательных разведений в жидкой или плотной питательной среде.

Метод диффузии в агар, или метод дисков. Испытуемую культуру засевают сплошным газоном на поверхность чашки Петри с мясопептонным агаром. Затем на поверхность агара помещают диски, пропитанные растворами антибиотиков 

Диски готовят из специального картона диаметром 6 мм. Содержание антибиотика в диске указывается на этикетке и соответствует рекомендации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ). Действие антибиотиков оценивают по феномену задержки роста вокруг диска после инкубации в термостате при 37°С в течение 18—24 ч. В зависимости от диаметра зоны задержки роста различают степень чувствительности испытуемого штамма: чувствительные (более 10 мм), малочувствительные (менее 10 мм) и устойчивые (отсутствие зоны). Вместо дисков при определении чувствительности микробов можно использовать цилиндрики (фарфоровые или металлические), куда заливают растворы антибиотика разной концентрации.

Метод последовательных разведений антибиотиков. Готовят серию двукратных разведений антибиотика в жидкой или плотной питательной среде, а затем в пробирки или на поверхность чашек Петри с каждым из разведений засевают испытуемую культуру микробов. После инкубации в термостате определяют минимальную подавляющую концентрацию антибиотика (МПК) по отсутствию роста в пробирке или на чашке с одним из разведений.