акушерство, гинекология и биотехника размножения

6.Минимальные показатели спермы, допускаемой

êразбавлению и хранению, и степень

ååразбавления

Обычно сперму быка разбавляют в 10

(1 : 9)…15 (1 : 14) раз. В некоторых странах разбавляют сперму 1 : 20 : 25 : 50.

Иногда сперму быка разбавляют 1 : 100

и даже 1 : 200. Такое различие в степе-

ни разбавления обусловлено разным

подходом к определению числа спермиев, необходимого для оплодотворе-

ния. Одни авторы считают, что в дозе

для осеменения одной коровы должно

быть минимум 10...15 млн живых спер-

миев, другие — 25...50 млн.

Состав сред зависит от вида живот-

ных и способа хранения спермы. Раз-

бавляют эякулят не позднее чем через

30 мин после его получения.

Впервые для разбавления спермы И. И. Иванов использовал физиологи- ческий раствор натрия хлорида (0,9%-

й). Однако он оказался малопригод-

ным для этой цели, так как его вязкость меньше вязкости спермы, и спермии в нем оседают; рН физиологического раствора колеблется

в пределах 5,6...6,2 и даже ниже, так

как дистиллированная вода поглощает из воздуха диоксид углерода. Затем предложили готовить физиологичес-

кий раствор с учетом видовых особен-

ностей спермы — подщелоченный са- харо-физиологический раствор натрия

хлорида. Были предложены: ГФО —

глюкозофосфатный разбавитель для

овец; ГСЛ — глюкозосульфатный раз-

бавитель для лошадей; ГТС — глюкозотартратный разбавитель для свиней; ГТКр — глюкозотартратный разбави-

тель для кроликов; ГТСо — глюкозо-

тартратный разбавитель для собак, желатинированный и др.

К. Н. Кржишковский и Г. Н. Павлов

(1927) установили важность включения

âразбавитель желтка куриного яйца

(лецитина) для выживаемости сперми-

ев. На основе этого с первой половины ХХ столетия широкое распространение

получили глюкозоцитратно-желточные

среды.

Âнастоящее время для краткосроч-

ного хранения спермы применяют разные среды (табл. 7).

Все компоненты для приготовления

разбавителей должны быть химически

чистыми, проверенными на токсич-

ность и соответствовать ГОСТу, указанному в инструкции по искусствен-

ному осеменению. Компоненты хранят

âсухом темном месте в плотно закры-

тых банках. Биологический контроль

обязателен для новой серии каждого препарата, особенно антибиотиков, до-

бавляемых в среду, так как некоторые

из них могут оказаться губительными

для спермиев. Разбавители готовят только на дистиллированной воде; в ней нет хлористых соединений, разру-

шающих оболочку спермиев.

Глюкоза, фруктоза, лактоза, сахароза и гликокол (аминоуксусная кислота) снижают электропроводимость раствора, предупреждая агглютинацию спер-

миев, связанную с потерей ими элект-

рических зарядов. Глюкозу и фруктозу спермии могут использовать как источ- ник энергии.

Âсперме быка и барана при хранении начинают образовываться молоч-

ная кислота и другие продукты обмена.

Для их нейтрализации, задержки набухания коллоидов цитоплазмы, оболоч-

ки спермиев, уменьшения их проница-

емости вводят в состав разбавителей

натрия цитрат (лимонно-кислый), яв-

ляющийся естественным буфером спермы (его рН 7,8...8,0). Поскольку в

сыворотке спермы жеребца и хряка со-

держится много солей, то в разбавитель

для спермы таких животных цитрат натрия не вводят или добавляют его в очень незначительных количествах.

Один из первых факторов внешней

среды, действующих на свежую спер-

му, — температура. При ее понижении (особенно ниже 18 °С) спермии подвергаются температурному шоку и гибнут. Для ослабления шока в разбави-

тель вводят желток куриного яйца, со-

держащий около 7 % неокисленного лецитина. Он одновременно является питательным веществом, предохраня-

ющим расходование липидов цитоп-

лазмы спермиев. Яйца должны быть обязательно свежими, с ярко окрашен-

ным желтком, получены от здоровых

кур, которым предоставляют полно-

ценные корма и достаточное движение.

В хорошем яйце содержатся полный

набор незаменимых аминокислот, углеводы, жироподобные вещества, пиг-

менты, микроэлементы, витамины. Яйца с загрязненной скорлупой непригодны: на поверхности скорлупы выявляли до 13 видов микробов и 7 видов плесневых грибов. Перед использова-

нием яиц скорлупу их необходимо об-

лучать бактерицидными лампами или протирать спиртовыми тампонами.

В сперме быка обнаружили белок семиналплазмин, сила действия кото-

рого на микрофлору соответствует пе-

нициллину, стрептомицину или тетрациклину. При разбавлении эякулята концентрация семиналплазмина снижа-

ется и соответственно уменьшается его

защитное действие. Для предупрежде-

ния отрицательного действия микро-

бов на спермиев в среду добавляют пенициллин, стрептомицин и белый ра-

створимый стрептоцид или смесь из перечисленных препаратов, выпускаемую под названием «спермосан-3», в

рекомендуемых дозах (см. табл. 7).

Опыты показали, что добавление в среду стрептоцида положительно сказывается на жизнеспособности спермиев,

но не приостанавливает рост микробов.

Пенициллин задерживает рост микро-

бов, но не повышает оплодотворяемос-

ти. Стрептомицин, угнетая рост микробов, в больших дозах отрицательно

влияет на спермиев. Учитывая тот

факт, что антибиотики являются имму-

нодепрессантами (А. М. Петров), сле-

дует осторожно использовать их при добавлении в сперму Если сперма име-

ет слабую микробную загрязненность,

то антибиотики применять не следует.

Среду нужно готовить с учетом того,

что ее компоненты делятся на термоустойчивые, которые можно стерилизо-

вать физическими методами (кипяче-

ние, автоклавирование), и термочув-

ствительные (желток куриного яйца,

глицерин, спермосан), не подвергаемые стерилизации. Сначала растворя-

ют в воде термоустойчивые компонен-

ты и 10 мин стерилизуют в кипящей

водяной бане. Затем остужают до 30...35 °С и добавляют термочувствительные компоненты. Среда находится

при указанной температуре не более 4 ч

в водяной бане или термостате. Остатки неиспользованных сред утилизируют.

Перед разбавлением среда и сперма

должны быть одинаковой температуры.

Для оценки качества спермы на чистое предметное стекло помещают каплю проверенной на активность спермы и к ней добавляют 2...3 капли среды, пробу накрывают покровным стеклом и ис-

следуют под микроскопом. Понижение

активности спермиев — свидетельство непригодности, а отсутствие заметных

изменений в сперме служит основани-

ем для использования разбавителя.

Хороший разбавитель для спермы быка, жеребца, хряка и других производителей — свежее молоко. Молочная

среда обладает большой буферностью,

понижает степень раздражения спермиев, увеличивает вязкость разбавленной спермы и имеет рН, сходную с ма-

точной слизью (Н. Н. Михайлов). Мо-

локо — самая биологически полноцен-

ная среда для спермиев, поэтому

сперму им можно разбавлять без опасения. Молочный разбавитель повышает

переживаемость спермиев, их оплодот-

воряющую способность, которая при

температуре 0 °С сохраняется до 7 сут.

Поэтому оплодотворяемость коров, кобыл при применении молочного разба-

вителя выше, чем при употреблении

желточно-цитратных разбавителей. В

качестве разбавителя можно применять

бавления и хранения спермы хряков

при температуре 16...20 °С в настоящее

время используют глюкозохелатоцитратную и глюкозохелатоцитратносуль-

фатную. Один из основных компонен-

тов этих сред — хелатон (двунатриевая

соль этилендиаминтетрауксусной кис-

ëîòû, Ñ10Í14Î8Na2N2). Хелатон, снижая обменные процессы в сперме, уве-

личивает срок переживаемости спер-

миев и предохраняет их акросому и оболочку от разрушения, тормозит размножение микробов, а на некоторые из них оказывает бактериолитическое

действие (Н. Т. Плишко). Наибольшая

переживаемость спермиев хряка — при разбавлении спермы 1 : 3. Уменьшение и увеличение степени разбавления снижают переживаемость спермиев.

При осеменении свиней фракцион-

ным методом А. В .Квасницкий пред-

ложил ряд сред, назначение которых — заполнить полости рогов матки, по-

этому их называют заполнителями:

глюкозосолевой (30 г глюкозы и 4,5 г

NaCl на 1 л дистиллированной воды); солевой (9 г NaCl на 1 л дистиллированной воды) и молочный (свежий об-

рат). Эти заполнители оказывают на

слизистую оболочку матки более благоприятное действие, чем желточно-цит- ратные и другие разбавители.

В Болгарии (Братанов, Иосифов,

Стоянов) предложен медовый разбави-

тель для спермы жеребца, быка и бара-

на. Установилено, что 7%-й водный раствор меда очень благоприятно дей-

ствует на спермиев. Добавление в разбавители для спермы быка и барана фосфатов и сульфатов улучшает их ка-

чество. Не следует использовать мед с

горьким вкусом.

Есть много сообщений о применении самых разных разбавителей. Во всех

случаях приготовления и использования

сред для спермы необходимо строго ру-

ководствоваться действующей инструк-

ций по искусственному осеменению соответствующего вида животных.

При хранении неразбавленной и

разбавленной спермы вне организма

изменяется плазма и нарушается акро-

сомный аппарат спермиев. Поэтому чем дольше удастся сохранить жизне-

способность спермиев вне организма

животного, тем шире можно приме-

нять метод искусственного осемене-

ния, так как запасы спермы позволяют без задержки осеменять маток в любое

время года, а главное в хозяйствах, рас-

положенных в десятках и даже тысячах

километров от станции искусственного

осеменения.

Существующие способы хранения спермиев вне организма основаны на

их физиологической способности пе-

реходить в состояние анабиоза, в котором они находятся, продвигаясь по каналу придатка тестикула. В естественных условиях анабиоз спермиев вызы-

вается повышенным содержанием

угольной кислоты (кислотный анабиоз). Следовательно, в соответствующих условиях можно хранить сперму вне организма при плюсовой температуре.

Исследования показали, а практика подтвердила, что температура — надеж-

ный регулятор скорости обмена ве-

ществ в сперме. Длительность хране-

ния спермиев определяется качеством

их анабиоза, который бывает непол-

ным и полным. При неполном анабио-

зе, когда обмен веществ в спермиях

только ослабляется в той или иной сте-

пени, возможно только краткосрочное их хранение (1...3 сут). При полном

анабиозе обмен веществ почти прекра-

щается, благодаря чему создается воз-

можность длительного хранения спер-

миев (на протяжении нескольких лет). Полный анабиоз достигается при замо-

раживании спермы.

Кратковременное хранение спермы при комнатной температуре (16...20 °Ñ). Äëÿ

хранения спермы хряков широко ис-

пользуют хелатные среды (см. табл. 7). Хелатон (трилон Б) — сокращенное на-

звание двунатриевой соли этилендиа-

минтетрауксусной кислоты. Это соединение при комнатной температуре инактивирует ферменты, подавляя таким образом обмен веществ у сперми-

ев. Действие хелатона снимается, если

сперма оказывается подогретой до температуры тела животного, и спермии на- чинают двигаться. Это происходит после введения спермы, разбавленной хелатной средой, в половые органы самки.

Известны также среды с угольной

кислотой для хранения спермы быков,

баранов и хряков при комнатной тем-

пературе, но они не получили широко-

го распространения.

Долговременное хранение спермы. Â

процессе хранения спермы при 2...5 °С в ней протекают обменные процессы,

отрицательно влияющие на оплодотво-

ряющую способность спермиев. Длительное хранение половых клеток возможно только в условиях полного ана-

биоза, когда все биохимические про-

цессы сильно замедляются.

В 1948 г. И. В. Смирнов впервые

осуществил замораживание спермы жеребцов, кроликов, быков и баранов в

пакетах из алюминиевой фольги на по-

верхности твердого диоксида углерода

(–79 °С) и в парах жидкого кислорода

(–183 °С). Однако бó льшая часть спермиев погибала, и после оттаивания

лишь 5...30 % спермиев сохраняли ак-

тивное поступательное движение. При-

меняя многократное осеменение такой

спермой на протяжении стадии возбуждения полового цикла, И. В. Смир-

нов в 1950...1951 гг. получил ягнят и те-

ëÿò.

В дальнейшем английские ученые

Полдж и Раусон (1952), используя защитное действие глицерина при ох-

лаждении спермиев, разработали при-

годный для производства метод дли-

тельного хранения спермы быка в жидком азоте (–196 °С). В настоящее время этот метод хранения спермы быка ши-

роко применяется у нас и за рубежом.

Хранение спермы в жидком азоте позволяет значительно улучшить породные качества разводимого скота, так как в тысячи раз увеличивается ко-

личество самок, осеменяемых спермой

ценных производителей. Осеменение коров такой спермой возможно на протяжении ряда лет. У спермы быка, хранящейся в жидком азоте, оплодотворяющая способность остается удовлетво-

рительной на протяжении 25 лет. Ме-

тод долговременного хранения спермы значительно увеличивает возможность

организации международного обмена

спермой выдающихся быков. Для хра-

нения спермы таких быков внутри страны и ее экспорта во многих странах организованы специальные банки

спермы. Для хранении спермы в жид-

ком азоте используется специальное холодильное оборудование (табл. 8).

8. Основные технические характеристики некоторых сосудов Дьюара для хранения замороженной спермы

* Сосуды можно использовать для транспортировки спермы

Известно, что замороженная сперма

сохраняет свои качества, когда ее хра-

нят погруженной в жидкий азот. Поскольку азот постоянно испаряется из

сосудов Дьюара, его необходимо пери-

одически доливать. В современных со-

судах Дьюара канистры (рис. 2.11) имеют боковое отверстие, через которое в них затекает жидкий азот при погруже-

нии и вытекает часть его при подъеме

канистры к горловине сосуда. Поскольку канистры разной длины, то их боковые отверстия находятся на различных расстояниях от верхнего среза

горловины сосуда. Поэтому доливать

жидкий азот нужно тогда, когда его уровень опускается до бокового отверстия самой длинной канистры, а запол-

нять их спермой следует только напо-

ловину (до отверстия), чтобы при

подъеме канистры в горловину сосуда

сперма оставалась в жидком азоте. Уровень азота в сосуде периодически

контролируется линейкой.

При работе с жидким азотом необходимо соблюдать правила техники безопасности. Два раза в год сосуды Дью-

ара подвергают профилактической де-

зинфекции, перед которой переносят сперму в другой сосуд, выливают остатки жидкого азота и отогревают сосуд в

закрытом помещении не менее 2 сут;

затем моют горячей водой (не выше

70 °С) и подвергают влажной дезин-

фекции.

При замораживании спермы можно

использовать несколько вариантов рас-

фасовки, при каждом из которых приме-

няют соответствующую среду (табл. 9).

Наиболее выраженными криозащитными свойствами обладают желток

куриных яиц, лактоза и глицерин. Но в

растворах этих веществ морфологичес-

кие изменения спермиев начинаются

уже при разбавлении спермы, а после эквилибрации ее патологические спер-

мии составляют в среднем 30 %.

Рис. 2.11. Устройство сосуда Дьюара для хранения замороженной спермы:

1 — внешняя и 2 — внутренняя стенки сосуда Дьюара; 3 — подвешивающее устройство канистры; 4 — корпус канистры; 5 — боковое отверстие в корпусе канистры; 6 — жидкий азот, находящийся в сосуде Дьюара

После разбавления сперму выдерживают при 2...5 °С в течение 2...6 ч (эквилибрация). Для замораживания

спермы в открытых гранулах берут

фторопластовую пластину, на которой

ñдвух сторон имеется по 300...324 лунки для накапывания спермы, обеззара-

живают ее с помощью бактерицидных

ламп, опускают в широкогорлый сосуд

ñжидким азотом и охлаждают до тех

пор, пока не прекратится кипение азота. Охлажденную пластину приподни-

мают над поверхностью жидкого азота

и при помощи шприца вносят по 0,1 мл

разбавленной спермы в каждую лунку.

Спустя 2...3 мин после внесения спермы в последнюю лунку пластину по-

гружают в жидкий азот на 1...2 мин.

После этого, вынув пластину, заморо-

женные гранулы собирают в пластмас-

совые коробочки с небольшими отверстиями (или в марлевые мешочки) и

хранят в жидком азоте. При таком

способе замораживания температура

внутри гранул спермы понижается бо-

лее равномерно, что обусловливает лучшее сохранение и высокую актив-

ность спермиев в оттаянной сперме.

Главный недостаток замораживания

спермы в гранулах — их незащищенность.

ÂПольше гранулы покрывают жела-

тиновыми капсулами. Под руковод-

ством Ф. И. Осташко (Украина) разработана харьковская технология замораживания спермы в облицованных (покрытых тонкой полимерной пленкой)

гранулах. Во Франции предпочитают

быстро замораживать сперму в «соломинках» (пайетты), которые одновременно служат инструментом для осеменения коров. Этот способ используют и в нашей стране. Хороший результат

дает технология замораживания спер-

мы в пропиленовых соломинках (байсогальская технология и по методике

И. Хабибуллина).

Важный фактор — сезон года. Опло-

дотворяемость коров от замороженной в летнее время спермы, как правило, низкая. Наиболее благоприятное время

для заготовки замороженной спермы —

весна и осень. Сперма некоторых быков плохо замораживается.

Разработана методика заморажива-

ния спермы жеребцов в гранулах или

алюминиевых пакетах (Е. М. Платов и

др.). Достаточную эффективность для

практики племенного коневодства показал метод длительного хранения

спермы жеребцов путем ее заморажи-

вания в искусственной среде ЛХЦЖ.

Для замораживания пригодна спер-

ма с подвижностью спермиев не ниже 5 баллов и концентрацией их не менее

150 млн в 1 мл. Технология заморажи-

вания такова: сперму, полученную на

искусственную вагину и профильтро-

ванную через 4 слоя марли, вначале проверяют на активность и концентра-

цию, затем разбавляют средой ЛХЦЖ в

соотношении 1 : 3 или 1 : 4, в зависимо-

сти от густоты спермы. Разбавленную

сперму охлаждают в холодильнике при 2...5 °С, после чего замораживают либо

на поверхности сухого льда в виде гра-

нул, либо в жидком азоте. При замора-

живании в виде гранул вносят по 0,2 мл спермы в лунки, сделанные на поверхности сухого льда, а через 5 мин после

замораживания гранулы собирают и

упаковывают в алюминиевые тубы по 125...130 шт. (это количество составляет дозу 25 мл). И только потом тубы с гранулами помещают на хранение в

жидкий азот.

Для замораживания спермы в жидком азоте ее разливают по 25 мл в охлажденные алюминиевые пакеты (стандартные тубы ¹ 16). При заполнении необходимо следить за тем, что-

бы в упаковке не осталось воздуха, ко-

торый при оттаивании может разорвать пакет. Алюминиевые тубы должны

быть обязательно маркированы с ука-

занием клички жеребца, породы и даты

замораживания спермы. Пакеты, заполненные подготовленной к замораживанию спермой, помещают в держа-

тели, которые вместе с поплавком пе-

реносят на поверхность жидкого азота. Испаритель опускают в жидкий азот широкогорлого сосуда Дьюара и кон-

тейнер закрывают крышкой (расстоя-

ние от пакета до жидкого азота —

20 мм), через 5 мин тубы с заморожен-

ной спермой переносят в жидкий азот на хранение.

Через 24 ч после замораживания

обязательно оттаивают несколько гра-

нул или один пакет (объем спермы в

контрольном пакете может быть уменьшен до 5 мл) из каждого эякулята и

проверяют на подвижность спермиев.

К дальнейшему хранению допускается

сперма с подвижностью спермиев не

ниже 2...2,5 баллов.

Замороженную сперму каждого же-

ребца рекомендуется хранить в отдель-

ных сосудах Дьюара. Использование

замороженной спермы жеребцов для

искусственного осеменения кобыл разрешается не ранее чем через 28 сут пос-

ле замораживания.

Для замораживания спермы хряка в

жидком азоте при –196 °С сперму получают 1 раз в 5...7 сут. В процессе ее получения отфильтровывают секрет

куперовых желез. Полученный фильт-

рат переливают в стеклянную посуду, закрывают ватной пробкой и выдерживают в темноте при 18...20 °С в течение 60 мин. Для замораживания использу-

ют эякуляты с активностью спермиев

на менее 8 баллов и концентрацией не менее 200 млн спермиев в 1 мл. Среда должна быть следующего состава: саха-

роза — 50 г, глюкоза — 8, фруктоза — 8,

сульфат аммония — 2 г, глицерин — 40 мл, желток куриного яйца — 50, динатрийэтилендиаминтетраацетат — 4,

тринатрийцитрат-3, трисаминометан —

0,6, бидистиллированная вода — 1000 мл.

Среда должна иметь рН 6,5.

После часовой выдержки при 18...20 °С сперму подогревают до 30 °С,

разбавляют 1 : 1 подогретой до этой же

температуры средой и, предварительно

дегазировав под вакуумом, насыщают

водородом. Затем сперму дополнительно выдерживают при 18...20 °С в тече-

ние 4 ч, после чего помещают в холо-

дильник (10 °С) и спустя 30 мин колбу

со спермой переносят на 10...15 мин в

тающий лед с водой (0 °С). Замораживают сперму в гранулах на

блоке сухого льда с лунками диаметром

1 см. Объем гранул 0,5 мл. Через 5 мин

после помещения в лунки гранулы пе-

реносят в жидкий азот для хранения. Оттаивают гранулы в специальном уст-

ройстве, обогреваемом от ультратермо-

стата водой, подогретой до 42...43 °С.

Устройство позволяет отделить жидкую фазу спермы от твердой в момент ее образования. Активность отта-

янной спермы составляет около 4...5

баллов. Свиноматок такой спермой осеменяют дважды в одну охоту дозой 100 мл, содержащей 3...5 млрд подвижных спермиев, соблюдая правила ин-

струкции.

На пунктах искусственного осеме-

нения оценивают только активность

движения спермиев. Для проверки ка-

чества спермы, сохраняемой при 2...5 °С , открывают термос, берут из

флакона каплю спермы, кладут на

Рис. 2.12. Фиксация оттаянной дозы спермы между двумя предметными стеклами с помощью пружинных зажимов (снизу) и бельевых прищепок (сверху)

перед исследованием на подвижность спермиев:

1 — предметное стекло; 2 — упаковка с гранулами спермы; 3 — зажимы для фиксации стекол; 4 — бельевые прищепки

предметное стекло и исследуют под

микроскопом подвижность спермиев.

Пробу надо брать быстро, чтобы не до-

пускать нагревания спермы. Исследуют сперму при температуре

40...41 °С, для этого используют обогре-

вательные столики различных конст-

рукций (В. А. Морозова и др.) или тер-

мостаты. Нельзя подогревать предметное стекло на пламени спиртовки или

другими методами без контроля темпе-

ратуры. При активности спермиев

быка ниже 7 баллов, барана — 8, жереб-

ца — 5 и хряка — 6 баллов сперма не пригодна для осеменения.

Порядок оттаивания замороженной

спермы приведен в таблице 10.

Оттаянную сперму в любой расфасовке вынимают из водяной бани и оставляют при 18...20 °С до использования, но не более 10...15 мин. Вновь за-

мораживать оттаянную сперму нельзя.

Подвижность спермиев в оттаянных необлицованных гранулах определяют так же, как в сперме, сохраненной при 2...5 °С. Оболочку упаковки доз спермы

в облицованных гранулах после оттаи-

вания гранул насухо вытирают марле-

вой салфеткой, край упаковки зажима-

ют между двумя предметными стекла-

ми 1 с помощью специальных пружин-

ных зажимов или бельевых прищепок (рис. 2.12), ставят на обогревательный