Радиобиология с основами радиоэкологии

7.3.Радиоустойчивость покоящихся клеток

Вопределенных ситуациях под влиянием как внутренних регуляторных механизмов, так и разнообразных внешних воздействий прохождение клеткой последовательных циклов деления может приостанавливаться, и клетка в этом случае оказывается вне цикла, переходя в уже упомянутое состояние покоя,

обозначаемое как G0-фаза. Покоящимися клетками называют такие клетки, которые вышли из цикла деления на неопре­ деленное как правило время, оставаясь при этом жизнеспо­ собными и полностью сохраняя пролиферативный потенциал.

Под влиянием адекватного стимула клетки, находящиеся в состоянии покоя, могут в любое время вернуться в цикл и приступить к делению. Поэтому покоящиеся клетки нельзя отождествлять со всем непролиферирующим пулом клеточной популяции, который может включать также клетки, необратимо утратившие способность к размножению и обреченные на гибель.

Долгое время считалось, что клетки переходят в покой после завершения очередного митоза. Позднее было установлено, что они могут переходить в него практически после завершения любой фазы клеточного цикла, хотя переход в покой из митоза, по-видимому, является наиболее предпочтительным.

Согласно общепринятой точке зрения, покоящиеся непролиферирующие клетки являются значительно менее чувствительными к действию различных повреждающих агентов, в том числе и ионизирующей радиации. В целом, такая устойчивость покоящихся клеток связывается с особенностями их метаболизма – крайним замедлением синтетических процессов, подавлением дыхания, низкой активностью большинства ферментных систем, за исключением ферментов катаболизма, и др. Что же касается повышения радиоустойчивости покоящихся клеток, то она совершенно однозначно связывается с меньшей повреждаемостью ионизирующей радиацией главной мишени – молекул ДНК – благодаря переходу хроматина в конденсированное состояние.

Тем не менее прямых доказательств повышенной радио­ устойчивости покоящихся клеток относительно немного (рис. 7.5). Но об этом всегда говорится, как о чем-то само собой разумеющемся. Основанием для этого является большое количество экспериментальных данных, полученных в исследованиях с критическими ор­ганами млекопитающих, меристе­мами­ растений, различны­ми­ видами опухолей, свидетельствующих об уменьшении пула покоящихся клеток при облучении. Обычно это связывается с их вступлением в клеточный цикл и переходом в пролиферирующий пул для компенсации опустошенного пула делящихся клеток. Это позволяет рассматривать пе-

Рис. 7.5. Кривые выживаемости активно делящихся (1) и покоящихся (2) клеток в культуре растений при гамма-облуче- нии.

реход клеток в состояние покоя как способ создания клеточных резервов ткани, служащих основой их восстановления.

Очевидно, изменения, возникающие в наиболее чувствительной субпопуляции делящихся клеток в ответ на воздействие иони-

зирующей радиации, и создают сигнал, необходимый для активации покоящихся клеток. По некоторым данным именно торможение пролиферативных процессов, образование блоков в клеточном цикле, гибель самых чувствительных клеток и другие процессы служат той информацией, которая приводит в движение нужный резерв – вывод выживших покоящихся клеток в пролиферацию.

Популяции покоящихся клеток гетерогенны. Многие исследователи выделяют несколько состояний покоя, различающихся по глубине. Так, у нормальных диплоидных фибробластов человека выделяют состояние раннего покоя, немногим отличающееся от состояния ранней G1-фазы; истинный покой, идентифицируемый уже как G0-состояние, и погружение в состояние еще более глубокого покоя. Различна реакция подобных клеток на стимулы разной природы, выводящие их из покоя. Если первые могут войти в клеточный цикл уже через несколько часов, то последние – гораздо позднее – через 20 ч и более. По некоторым данным клетки покоящегося центра меристем растений могут находиться в состоянии глубокого покоя до нескольких сот часов. Соответственно различаются они и по радиочувствительности.

Выход покоящихся клеток в пролиферацию еще до массовой гибели делящихся клеток у различных объектов уже через 3–6 ч, а у некоторых даже через 1–2 ч свидетельствует о том, что информационное взаимодействие осуществляется на самых ранних этапах ответа популяции на излучение.

Покоящиеся клетки отличает значительное снижение дыхательной активности, что было показано на культуре клеток животных путем прямого измерения количества потребляемого кислорода. Установлено, что только за счет снижения концентрации кислорода, т.е. ослабления кислородного эффекта, ра-

диоустойчивость клеток при переходе в состояние покоя может повышаться приблизительно в два раза.

Несомненно, способность клеток переходить в состояние покоя является общим свойством живых систем, которым обладают прокариоты, простейшие эукариоты, ткани многоклеточных растений и животных. Эта способность проявляется на протяжении всего периода индивидуального развития организма как в норме, так и при патологии. Доказано, что покоящиеся клетки имеются и в опухолях. Именно с их существованием нередко связываются неудачи лучевой терапии злокачественных новообразований. Поэтому проблема избирательного поражения покоящихся клеток опухолей, например, под влиянием стимулирующих факторов, приобретает первостепенное значение в онкологии.

7.4. Гибель клеток при облучении

Первые видимые реакции делящихся клеток на облучение ионизирующей радиацией – задержка их вступления в митоз и полное прекращение митозов, свидетельствующие, как правило, о замедлении, задержке клеточного цикла и его остановке. Степень задержки деления при остром облучении зависит от фазы цикла – при облучении в радиочувствительные фазы она выражена значительно сильнее. Более того, при достаточно высоких дозах клетки, находящиеся в радиочувствительных фазах, могут потерять способность к последующему делению.

У клеток, сохранивших способность к делению, после вступ­ ления в митоз дальнейшая участь складывается по-разному. Некоторые тут же приступают к подготовке к следующему делению. Однако отдельные клетки после первого митоза теряют способность к делению – гибнут. Еще больше клеток может погибать после второго, третьего и последующих митозов. Гибель клеток тоже может проходить по-разному. Одни клетки, потеряв способность к делению, могут перейти к дифференциации; другие разрушаются, подвергаясь лизису; третьи начинают увеличиваться в размерах, вследствие чего в популяции появляются гигантские клетки, в десятки и даже сотни раз превышающие размер нормальных. Как правило, это не является следствием простого набухания, а увеличения общего содержания метаболитов – нуклеиновых кислот, белков и др. В итоге такие клетки погибают.

Различают две основные формы гибели клеток – пролифе­ ративную, или репродуктивную гибель и интерфазную гибель, или апоптоз.

Пролиферативная гибель – это потеря клеткой способности к делению. Естественно, что она может наступать только у делящихся клеток. И зарегистрировать ее можно визуально под

микроскопом по отсутствию митотических клеток или потере клоногенной активности (способности к образованию клеточных колоний у бактерий, дрожжей, клеток в культуре in vitro, селезеночных колоний). Более тонкими методами можно судить о пролиферативной гибели по потере способности к включению метаболитов, обеспечивающих процессы деления клеток, обычно специфических меченых предшественников синтеза ДНК. Такие клетки сохраняют жизнеспособность и нередко способность к дифференциации и последующей специализации.

Причиной пролиферативной гибели клеток являются структурные повреждения ДНК: нарушение структуры оснований, одиночные и двойные разрывы цепи молекулы, образование внутри- и межмолекулярных сшивок, разрушение вторичной структуры главным образом из-за разрыва водородных связей, итогом которых могут стать денатурация и деполимеризация макромолекулы. Отдельные типы повреждений регистрируются с помощью различных методов, но одним из наиболее распространенных интегральных методов является наблюдение аберраций хромосом, или хромосомных перестроек. Они легко обнаруживаются в метафазе, анафазе и телофазе митоза в виде всевозможных нарушений хромосом: фрагментов – частей хромосом, образующихся при их разрывах; кольцевых хромосом и дицентриков, возникающих вследствие деформации и слипания концов хромосом; одинарных (хроматидных) и двойных (хромосомных) мостов – отставших при расхождении к полюсам хромосом, образующих как бы соединение между сгруппировавшимися в анафазе хромосомами; внутри- и межхромосомных обменов и некоторых других (рис. 7.6). Большинство из них приводит к неравномерному распределению генетического материала между дочерними клетками и в результате его нехватки деление прекращается. Другие, как, например, мосты механически препятствуют делению.

Проведенные многими исследователями расчеты свидетельствуют, что при общем облучении организма в дозе 1 Гр в ДНК каждой клетки возникает от 10 до 100 двойных разрывов, любой из которых может стать причиной возникновения аберрации. Как правило, при такой дозе в клетках и животных, и растений регистрируется не более двух-трех аберраций на клетку. Причиной этого, с одной стороны, является то, что аберрации хромосом проявляются не сразу, а лишь у потомков облученных клеток. С другой – большая часть разрывов восстанавливается с помощью систем репарации, эффективность которых с течение времени после облучения возрастает. Кроме того, могут формироваться такие типы аберраций, которые визуально не выявляются.

В целом на самых разных объектах продемонстрирована четкая обратная корреляция между количеством аберраций

Рис. 7.6. Некоторые виды аберраций хромосом, возникающих в клетках при действии ионизирующей радиации.

хромосом и выживаемостью клеток. Всевозможные факторы радиозащитной природы, как физические, так и химические, уменьшающие количество аберраций, приводят и к повышению выживаемости. Именно поэтому аберрации хромосом уже давно являются одним из самых используемых критериев радиационного поражения.

Эту форму гибели клеток иногда еще называют «гибелью при делении», «митотической гибелью», «митотической катастрофой», «отсроченной гибелью». Но термины «пролиферативная гибель» и «репродуктивная гибель» получили наибольшее распространение.

Интерфазная гибель – это полная потеря жизнеспособности, приводящая в итоге к лизису клетки. Она не зависит от способности к делению и может наступить в любой клетке, не только делящейся, но и дифференцированной функционирующей, и в любой момент. Во всех случаях наступает в интерфазе, а у делящихся клеток – до вступления в митоз, поэтому ее называют «немитотической гибелью», «гибелью в отсутствие деления», но чаще – «интерфазной гибелью». Интерфазная ги­ бель еще получила название «апоптоз» (от греческих составных частей сложных слов-терминов «апо…» – без и «…птоз» – падение, падеж, гибель; вместе – гибель без митоза, деления).

Интерфазной гибели предшествуют определенные физио- лого-биохимические и морфологические изменения в клетках. Ингибируется окислительное фосфорилирование, повышается активность протеолитических ферментов, происходит деградация дезоксирибонуклеопротеидного комплекса, увеличивается

проницаемость внутриклеточных мембран. Наблюдаются пикноз ядер, дегенерация ядрышек, вакуолизация клетки с последующим ее распадом и рассасыванием. Гибель делящихся клеток происходит в течение первого цикла деления, функционирующих – нескольких часов–первых суток в зависимости от типа клеток и дозы облучения. При очень высоких дозах клетка может погибать сразу же после облучения – так называемая «гибель под лучом», поэтому интерфазную гибель называют еще «немедленной гибелью».

Каждое из многочисленных названий пролиферативной и интерфазной гибели клеток по-своему подчеркивает ее особенности.

7.5. Количественная оценка выживаемости клеток

Уже на втором этапе развития радиобиологии – в начале 1920-х гг. – было обнаружено очень важное явление, впоследствии получившее статус закономерности, – вероятностная природа проявления реакции клеток на действие ионизирующей радиации. При исследовании доли погибших клеток от дозы с самыми различными одноклеточными объектами было установлено, что даже при самых малых дозах облучения может быть зарегистрирован, хотя и с малой вероятностью, экстремальный эффект – гибель клетки, т.е. показано, что дозовая зависимость не имеет порога. С увеличением дозы растет количество погибших клеток, но даже при очень высоких дозах, опять же с небольшой вероятностью, некоторое число клеток может сохранять жизнеспособность. При этом с повышением дозы не столько увеличивается степень повреждения клетки, оцениваемая, например, по количеству аберраций хромосом на клетку, сколько возрастает численность поврежденных клеток; опираясь на тот же пример – количество клеток с аберрациями или погибших клеток.

Такая зависимость в линейной системе координат, как правило, изображается в виде экспоненциальной кривой, которая, если выразить выживаемость (повреждаемость) клеток в логарифмическом масштабе, приобретает форму прямой (рис. 7.7). Аналитическое выражение, описывающее ее, представляет собой типичную экспоненциальную функцию.

N/N0 = e–kD,

где N0 – количество клеток, облученных в дозе D; N – количество клеток, выживших после облучения; k – коэффициент, характеризующий угол наклона кривой к оси абсцисс, е – основание натурального логарифма.

Рис. 7.7. Типичные кривые зависимости выживаемости клеток от дозы ионизирующей радиации при облучении одноклеточных объектов (бактерии, дрожжи, клетки в культуре и другие), пояснение в тексте.

Коэффициент k в данной формуле играет очень важную роль, так как по углу наклона кривой можно судить о реакции клеток на облучение – чем она круче, тем выше радиочувствительность клеток. Под влиянием различных факторов, модифицирующих радиочувствительность, угол наклона изменяется, и по его крутизне можно судить как о характере модификации (снижение – радиозащита или повы-

шение – радиосенсибилизация), так и о степени ее проявления. Для характеристики радиочувствительности клеток используют уровни доз, при которых в популяции выживает определенное их количество. Чаще всего используют значение дозы, при которой выживают и соответственно погибают 50% клеток. Это – полулетальная доза D50 (LD50, или ЛД50, обычно используют для обозначения полулетальных доз для многоклеточных организмов). Но нередко с той или иной целью используют уровни доз, при которых выживает большее или меньшее количество клеток. Оценить любой уровень выживаемости на

прямолинейных кривых не составляет труда.

Однако очень часто в области малых значений доз, т.е. при низких уровнях повреждения, увеличение дозы не сопровождается существенным снижением выживаемости, другими словами, зависимость доза–эффект несколько отклоняется от экспоненциальной (кривая 2). Эта начальная часть кривой называется «плечом».

В зависимости от биологических особенностей популяции клеток, вида радиации и других обстоятельств и факторов размер плеча может быть различным. Его характеризуют два основных параметра – экстраполяционное число n и размер пле-

ча Dq.

Число n – это точка пересечения продолжения (экстраполяции) линейного участка дозовой кривой с осью ординат. Естественно, что оно зависит от угла наклона кривой и будет тем выше, чем выше радиочувствительность клеточной популяции.

Величину Dq называют квазипороговой дозой. Ее получают путем пересечения прямой, проведенной из точки полной 100%-ной выживаемости клеток параллельно оси абсцисс, с экстраполируемым участком кривой. Количественно она равна соответствующей дозе на этой оси и в определенной степени характеризует способность клеток к восстановлению.

Такие кривые (зависимости) с плечом хорошо описываются уравнением

N = N0 e–D/Do,

где D0 – доза, при которой доля живых клеток уменьшается по сравнению с исходной в е раз, т.е.

N/N0 = e–1 = 1/2.71 = 0.367.

Это число, округленное до 0.37, означает, что при дозе D0 выживает примерно 37% клеток и погибает соответственно около 63%. Поэтому ее еще обозначают D37. В случае экспоненциальных кривых D0 и D37 – одни и те же, но для кривых, имеющих плечо, они различны.

7.6. Молекулярно-биохимические процессы, лежащие в основе гибели клеток

Всестороннее исследование механизмов радиационного поражения с помощью различных биохимических, биофизических, цитологических методов однозначно доказывает, что молекула ДНК, локализованная в хромосомах клеточного ядра, является главной мишенью действия ионизирующих излучений, и возникающие в ней повреждения оказываются определяющими в пролиферативной гибели клетки. В логарифмической шкале координат показана линейная зависимость между объемом хромосом и радиочувствительностью клеток и близкая к ней зависимость между объемом клеточного ядра и радиочувствительностью – чем больше объем, тем выше чувствительность к действию излучений самой различной природы.

Существует корреляция между содержанием ДНК и радиочувствительностью клеток – логарифм количества нуклеотидов на геном линейно связан с логарифмом дозы D37.

На самых различных объектах установлено, что облучение редкоионизирующей радиацией в дозе D0 приводит к возникновению в ДНК делящихся клеток от 500 до 1000 однонитевых и 50–70 двунитевых разрывов полинуклеотидной цепи. Разрывы в ДНК служат причиной нарушений деления клеток. Одно из свидетельств – появление клеток с аберрациями хромосом и задержка прохождения клетками цикла деления. Данные нарушения могут не быть фатальными для клетки, и она образу-

радиочувствительностью их клеток, которые, однако, в зависимости от пролиферативной активности и степени дифференцировки в соответствии с законом Бергонье и Трибондо существенно различаются по данному признаку. Выделяют пять ос­ новных групп клеток в зависимости от их чувствительности

кионизирующим излучениям.

Кпервой наиболее радиочувствительной группе относят в основном быстро делящиеся клетки постоянно обновляющихся тканей: гемоцитобласты – стволовые клетки системы кроветворения и их прямые производные – лимфобласты, эритробласты, миелобласты, мегакариобласты и монобласты; сперматогонии типа А и оогонии; эпидермальные клетки, слабодифференцированные клетки крипт кишечника, низкодифференцированные клетки слизистой желудка и голокринных желез и некоторые другие. Лимфоциты не относятся к быстро делящимся клеткам, но включены в эту группу ввиду их высокой радиочувствительности, обусловленной структурными причинами.

Ко второй группе относятся интермитотические дочерние клетки, образующиеся в ходе гемопоэза, которые вступают на путь дифференциации и становятся более радиоустойчивыми. Это промежуточные стадии в миелопоэзе и эритропоэзе – мегалобласты, нормобласты и др.; оогонии, сперматогонии типа В.

В третью группу входят мультипотентные соединительно­ тканные клетки. Они делятся нерегулярно, обычно в ответ на повреждение и раздражение. Это – эндотелиальные клетки кровеносных и лимфатических сосудов, фибробласты и мезенхимные клетки, например, мезотелия – эпителия серозных оболочек.

Кчетвертой группе относят покоящиеся клетки, которые в норме обычно не делятся и обладают относительно высокой радиоустойчивостью. К ним относят клетки эпителия слюнных желез, печени, почек, поджелудочной железы, интерстициальные клетки семенников и яичников, септальные клетки легких и ретикулярные клетки кроветворных тканей.

Кпятой, самой радиоустойчивой группе принадлежат специализированные функционирующие клетки, например, зрелые эритроциты, зрелые нервные и мышечные клетки, сперматозоиды и некоторые другие.

В связи с тем, что радиочувствительность клеток зависит от скорости их деления, различные факторы, повышающие пролиферацию, ее увеличивают. Таким образом, поэтины – вещества, ускоряющие гемопоэз, могут существенно повышать радиочувствительность как стволовых клеток, так и форменных элементов крови: эритроцитов, гранулоцитов, моноцитов, тромбоцитов. Ангиогенные факторы, активирующие пролиферацию