Гистология Klinicheskaya_embriologia_chitala_O_V_Shurygina

Клиническая эмбриология

(19 ноября 2013 года. Лектор: Шурыгина О.В.)

Эмбриология изучает развитие зародыша от момента оплодотворения до рождения, а также процессы прогенеза – образование мужской и женской половых клеток.

Медицинская эмбриология изучает закономерности эмбрионального развития человека, причины нарушений и возникновения уродств, а также пути и способы влияния на эмбриогенез.

Почему происходит изменение в развитии?

Почему из одной клетки развивается многоклеточный организм?

Что определяет ход развития?

Какие факторы предопределяют и влияют на развитие человека?

Какие современные методы клеточной биологии помогают в решении проблем здоровья человека?

• 1677г. А. Leeuwenhoek с помощью сконструированного им микроскопа впервые исследовал сперму человека и не только обнаружил в ней «живчиков, зверьков» («анималькули»)-сперматозоиды, но и связал с ними акт зачатия. Анималь-

Кулисты (Г.Лейбниц,

А.Левенгук)

• 1795 г. J. Hunter впервые осуществил искусственную инсеминацию, введя во влагалище женщины эякулят ее мужа.

Отечественная эмбриология

• К.М.Бэр – создал учение о зародышевых листках, из которых развиваются все ткани и органы. Он доказал, что человек развивается по тому же плану, что и все позвоночные

• Был первым, кто изучил яйцеклетку под микроскопом

• Дарственная медаль Академии наук «Начав с яйца, он показал человеку человека»

• 1827 г.- К.Е. Von Baer впервые описал яйцеклетки млекопитающего. Овисты (М.Мальпиги, Ш.Бонне).

• 1880 г. S.L. Schenk- первая попытка оплодотворения in vitro у млекопитающих.

• 1891 г. W. Heape осуществил успешную трансплантацию (перенос эмбриона) от одной самки кролика другой с последующим рождением потомства.

• 1897 г.- В.С. Груздев опубликовал статью, посвященную исследованиям по оплодотворению извлеченных из фолликулов крольчихи яйцеклеток, которые он затем во взвеси со спермой переносил в яйцевод животного.

• 1926-1929 г.- В. Zondek. Открытие гонадотропной функции гипофиза.

• 1932 г.- Вышел в свет роман А. Huxley «прекрасный новый мир» в котором был описан метод ЭКО.

• 1934г.- О.В. Красовская сообщила об оплодотворении яйцеклеток кролика in vitro.

1952г. – В результате обследования 49000 фертильных мужчин разработаны критерии оценки фертильности спермы

• 1955-1959г. Петров Г.Н. – первые исследования оплодотворения яйцеклетки вне организма.

• 1966г.- R.G.Edwards установил, что созревание женских яйцеклеток in vitro происходит в течение 36-37 часов после пика ЛГ.

• 1968г. – Начало совместной работы эмбриолога R.G. Edwards с гинекологом P.C. Streptoe

• 2010г .Нобелевская премия за

достижения в развитии ВРТ

(R.G. Edwards)

• 1975г.-R.G. Edwards и P.C. Streptoe получили первую беременность после ЭКО.

• 1978г- Рождение

первого в мире

«ребенка из

пробирки»

Луизы Браун.

25 июля 1978 года, Кембриджский Университет Великобритания

- рождение первого «ребенка из пробирки»

• 1983г.- Первые роды после переноса размороженных эмбрионов, полученных in vitro.

• 1984г.- Впервые произведена пункция и получение ооциов из яичников под УЗИ контролем

• Начало проведение процедуры ЭКО с использованием индукции суперовуляции

• 1986г.-Рождение первых детей из пробирки в СССР (Е.А.Калинина, Л.В. Хилькевич)

• 2007 г. – естественное зачатие и рождение «первого внука ЭКО» (Россия)

• 1994г.-Первые сообщения о беременностях после ИКСИ с

использованием сперматозоидов,

полученных в результате пункции

яичка или его придатка

• 2002г.- Родился 1000000 ребенок «из пробирки»

• 2007г. – Родился 3000000 ребенок «из пробирки»

• 2010 г. – более 5 млн. детей «из пробирки»

• В России ежегодно рождается около 8,3 тыс. детей

Коэффициент фертильности снижается в Европе. Становится Ниже Коэффициента Воспроизводства Населения

Снижение фертильности с возрастом неразрывно связано с овариальным резервом.

Частота встречаемости хромосомных аномалий плода возрастает с увеличением материнского возраста.

Этапы эмбрионального развития

• Начальный (до 7 дн.)

• Зародышевый (до 8 нед.)

• Плодный (после 8 нед.)

Основные стадии эмбриогенеза:

1.Оплодотворение

2. Дробление

3. Гаструляция

4. Гистогенез, органогенез, системогенез

Яйцеклетка (100-200 мкм) Снаружи окружена фолликулярными клетками. Имеет 3 оболочки: оволемма, блестящая зона, лучистый венец. Хорошо развиты мтх, в цистернах ЭПС – кальциевые депо. Желток представлен в виде желточных гранул, его запаса хватает на 24 часа автономного существования яйцеклетки.

На цитомембране яйцеклетки есть рецепторы для сперматозоидов. Яйцеклетка человека имеет 2 дополнительные оболочки: блестящую оболочку, состоящую из гликозамингликанов, и лучистый венец (zona pellucida; corona radiata), образованный из фолликулярных клеток, которые прилипают к яйцеклетке пока она находится в фолликуле яичника.

Сперматозоид 65-67 мкм

Состоит из головки, шейки и хвоста. В головке - ядро с конденсированным неактивным хроматином. Верхнюю часть головки занимает акросома, содержащая несколько десятков ферментов, которые активизируются в ходе акросомальной реакции и обеспечивают проникновение сперматозоида через все оболочки яйцеклетки.

Хвост, длиной до 60 мкм. В нижней части шейки сперматозоида локализована центриоль, именно она обеспечивает возможность дробления оплодотворенной яйцеклетки.

В среднем отделе компактно, по окружности хвоста, располагаются митохондрии – источник энергии, необходимой для двигательной активности.

Гипоталамо-гипофизарная связь

В средней части гипоталамуса располагаются аркуатное и вентромедиальные ядра. Нейросекреторные ядра клетки этих ядер синтезируют 2 группы аденогипофизтроных гормонов: . Либерины - 6 различных лабиринов, соответственно для 6 видов клеток передней и промежуточной доли гипофиза ( усиливают функцию клеток этих долей гипофиза). . Статины - тоже 6 разновидностей - тормозят работу (снижают функции) клеток передней и промежуточной доли гипофиза.

Гормональная регуляция

• ФСГ – выработка сперматозоидов в семенных канальцах, воздействует на клетки Сертоли (выработка ингибина), стимулирует выработку тестостерона в клетках Лейдига (тестостерон по механизму обратной связи контролирует синтез ЛГ; рост и развитие фолликулов

• ЛГ - стимулирует синтез эстрогена и прогестерона; синтез тестостерона

Оплодотворение – это слияние мужской и женской половых клеток с образованием одноклеточного зародыша – зиготы с диплоидным набором хромосом.

Схема последовательных этапов процесса оплодотворения

• дистантное взаимодействие- встреча гамет в половых путях женщины

• контактное взаимодействие

• проникновение сперматозоида в яйцеклетку с последующими в ней изменениями - пенетрация

Фазы оплодотворения:

• 1. Дистантное взаимодействие — сближение сперматозоидов с яйцеклеткой под действием веществ, выделяемых яйцеклеткой.

• 2. Контактное взаимодействие — происходит акросомальная реакция сперматозоида, при которой высвобождаются ферменты из акросомы и разрушают небольшой участок блестящей оболочки.

• 3. Проникновение головки и шейки сперматозоида в ооплазму. В эту фазу происходит взаимодействие между рецепторами сперматозоида и яйцеклетки, после чего их мембраны сливаются, и головка и шейка сперматозоида оказываются в ооплазме. После проникновения одного сперматозоида в яйцеклетке возникает кортикальная реакция

Кортикальная реакция – препятствует полиспермии

В ооплазму входят ионы натрия, в результате чего меняется заряд цитомембраны яйцеклетки (с отрицательного на положительный). Кроме того, в ооплазме резко повышается концентрация ионов кальция. Все это приводит к тому, что кортикальные гранулы начинают двигаться к цитомембране яйцеклетки и их мембрана сливается с цитомембраной яйцеклетки, т.е. происходит экзоцитоз кортикальных гранул. Ферменты кортикальных гранул разрушают рецепторы для сперматозоидов и изменяют свойство блестящей оболочки, в результате чего другие сперматозоиды уже не могут проникнуть в ооплазму. Цитомембрана и блестящая оболочка яйцеклетки с видоизмененными свойствами получают название оболочки оплодотворения. После проникновения сперматозоида в яйцеклетку ядра этих клеток сначала располагаются по отдельности (стадия двух пронуклеусов), а потом сливаются (синкарион).

Нормальное оплодотворение, образование двух пронуклексов

Имплантация – внедрение зародыша в слизистую оболочку матки (начало на 7 сутки, заканчивается на 11-12 день)

• Две стадии имплантации:

• 1- адгезия;

• 2- инвазия.

Гаструляция

Одновременно с процессом имплантации в зародыше человека начинается гаструляция. Это сложный процесс химических и морфогенетических изменений, сопровождающийся размножением, ростом, направленным движением дифференцировкой клеток, в результате чего образуется гаструла, содержащая три зародышевых листка – экто-, энто-, мезодерму.

Первая фаза гаструляции начинается на 7-е сутки эмбриогенеза и протекает одновременно с имплантацией. Осуществляется она путем деламинации. Эмбриобласт расщепляется на два зародышевых листка: эпибласт (первичная эктодерма) и гипобласт (первичная энтодерма). Клетки эпибласта служат источником развития всего зародыша и амниотической эктодермы. Клетки гипобласта перемещаются по внутренней поверхности трофобласта и участвуют в образовании стенки желточного мешка, которая плотно прилежит к трофобласту. На этом первая фаза гаструляции, которая протекает всю 2-ую нед развития.

Вторая фаза гаструляции – иммиграция - начинается на 14-15 день эмбрионального развития.

Основные процессы 2-ой фазы гаструляции протекают в эпибласте. Клетки эпибласта усиленно размножаются и перемещаются в краниокаудальном направлении (от переднего конца к заднему). У каудального конца зародыша 2 клеточных потока встречаются, поворачиваются и устремляются уже кпереди. В результате в центре эпибласта образуется скопление клеток, которое называется первичной полоской. Впереди от первичной полоски формируется первичный, или гензеновский, узелок.

Особенности гаструляции у человека

характерна гетерохронность дифференцировки клеточного материала эмбриональных зачатков - обособление эмбриональных зачатков происходит раньше. Зародышевые листки состоят не из однородного материала, а представляют собой сразу «мозаику» различных дифференцирующихся эмбриональных зачатков. Клеточный материал эмбриональных зачатков детерминируется на более ранних стадиях в период гаструляции, чем у млекопитающих. И в результате последующей специфической дифференцировки из них развиваются вполне определенные ткани и органы

Аномалии (врожденные пороки развития)

Тератология – раздел эмбриологии, изучающий нарушение строения эмбрионального развития, их причины и результаты

Аномалия – состояние, при котором орган или организм в целом выходит за рамки допускаемых представлений о возможных вариантах нормального

Как правило, это нарушения раннего эмбриогенеза

• Нарушения структуры ткани, органа, части тела

• «функциональные нарушения» – генетически обусловленные врожденные дефекты (энзимопатии – фенилкетонурия)

• ВПР – 1:50 новорожденных

• Частота конкретного ВПР – его отношение ко всей популяции: неопущение яичек 1:300; незаращение межпредсердной перегородки 1:5; расщепление губы и мягкого неба 1:1000; удвоение матки 1:1500

Классификация ВПР по механизму развития:

• Нарушение развития – эмбриональный зачаток не возникает вообще или не развивается до необходимого (агенезия почки, влагалища)

• Остановка развития – прекращение прогрессивного развития (двурогая матка, атрезия пищевода, др.)

• Чрезмерный рост органа (гипертрихоз)

• Слияние или расщепление органа (удвоение мочеточника, подковообразная почка)

• Нарушение способности целого делиться (синдактилия)

• Нарушение способности эмбрионального материала к атрофии, приводящее к персистенции временных структур (мембраны)

• Нарушение единого целого в ходе формирования дефинитивных органов (добавочные органы)

• Нарушение процессов миграции (неопущение яичек)

Причины ВПР

• Внешнесредовые (химические, физические, биологические, экстремально-ситуационные)

• Биологические (генетические, тератогенные, хромосомно-патогенные, онкогенные)

• Социальные

20% ВПР – генные нарушения

10% - хромосомные абберации (нарушения организации хромосом)

10% - внутриутробные инфекции

60% - невыясненная этиология

Методы ВРТ (вспомогательных репродуктивных технологий)

это методы лечения бесплодия,  при которых отдельные или все  этапы зачатия и раннего развития эмбрионов осуществляются вне организма.  

• ЭКО  (экстракорпоральное  оплодотво-рение) 

• ИКСИ (инъекция  сперматозоида  в цитоплазму   яйцеклетки)

• Донорство яйцеклеток

• Суррогатное     материнство

• PGD(преимплантационная диагностика наследственных болезней эмбриона)

• IVM (дозревание яйцеклетки вне организма

• Замораживание ооцитов , спермы, эмбрионов, яичниковой ткани

• Вспомогательный хетчинг

Основные лабораторные этапы программы in vitro оплодотворения ( ЭКО )

• Пункция фолликулов под ультразвуковым контролем

• Поиск и идентификация ооцит -кумулюсных комплексов

• Контроль стадии зрелости ооцитов

• Обработка спермы

• Инсеминация ооцитов

• Контроль оплодотворения

• Культивирование и оценка морфологии эмбрионов

• Выбор эмбрионов и перенос эмбрионов

Морфологическое исследование спермы (выявление сперматозоидов с аномалиями головки, шейки)

ИКСИ (ICSI)

Метод оплодотворения путем введения одного сперматозоида в яйцеклетку

PICSI

• Новый метод селекции сперматозоидов PICSI

• Селективный отбор сперматозоидов проводится на чашках PICSI перед процедурой ИКСИ с предшествующим определением на стеклах НВА.

• Селекция сперматозоидов в программах ИКСИ – является ключевым моментом, определяющим влиянием мужской гаметы на доимплантационное развитие эмбрионов.

• Использование данной методики в ИКСИ позволяет выбрать более функционально компетентные сперматозоиды, что позитивно влияет на вклад отцовской гаметы в доимплантационный эмбриогенез

Параметры оценки качества эмбрионов

• Наличие фрагментации

• Сферичность бластомеров

• Равные размеры бластомеров

• Аномалии зоны пелюцида

• Аномалии цитоплазмы

• Мультинуклеированные бластомеры

Вспомогательный хетчинг

Нанесение насечки в оболочке эмбриона для облегчения его выхода из оболочки оплодотворения и имплантации при в полость матки.

Оценка эмбрионов: дополнительные критерии

• Генетические маркеры

  • PGS

  • анализ полярного тельца

  • митохондриальная ДНК

• Морфокинетка

  • time-lapse например

• Биохимические маркеры

  • аминокислотный профиль

  • инфракрасная спектроскопия

• Дыхание

  • потребление кислорода

  • метаболизм пирувата/глюкозы

Технология серийной съемки позволяет выбрать один качественный эмбрион с максимальной возможностью к имплантации

Оценка эмбрионов: морфокинетика

• Описывает большое количество параметров, потенциально характеризующих компетентность эмбриона

• Выделяет важнейшие параметры, влияющие на результативность

• Алгоритм EEVA позволяет оценить вероятность формирования бластоцисты

• Значительно увеличивает шансы эмбриолога на выбор лучших эмбрионов

• Сводит к минимуму различия в видении разных эмбриологов

• Возможный путь увеличения ЧКБ

Нарушение имплантации

Привычное невынашивание беременности

• Пренатальный генетический скрининг

  • CGH (Scott et al.,2012; Handyside et al., 2012)

  • Неэффективность FISH диагностики

• MSOME + IMSI

  • Увеличение частоты наступления беременности в группе пациенток с повторным отсутствием имплантации (Bartoov , 2002, 2003, Cassuto 2009)

  • Снижение частоты преждевременных родов при использовании IMSI по сравнению со стандартным ИКСИ (Cassuto et al., 2012)

  • PICSI /Sperm Slow

  • Снижение числа прерываний беременности в группе пациентов с индексом зрелости сперматозоидов <65 (Worrilow et al., 2009)

  • Влияние на иммунное взаимодействие эмбриона и эндометрия

  • Ко-культивирование эмбриона и клеток эндометрия (Spandorfer et al., 2008)

  • Орошение полости матки ростовыми факторами перед переносом (Stamenow et al., 2011)

  • Использование метаболизированной среды при переносе эмбрионов

  • Использование клеток гранулёзы

Цитокины и доимплантационное развитие эмбриона

• На протяжении всего процесса доимплантационного развития в репродуктивном тракте – от оплодотворения до имплантации – эмбрион подвергается воздействию цитокинов и ростовых факторов

Цитокины и ростовые факторы регулируют процессы выживания и пролиферации клеток

Роль факторов роста в наступлении и поддержании беременности

До имплантации

• Регуляция процессов деления и дифференцировки клеток эмбриона

• Регуляция взаимодейстивия бластоцисты с поверхностным эпителием и эндометрием

Во время имплантации

• Обеспечение адгезии и пролиферации трофобласта

• Обеспечение инвазии трофобласта

После имплантации

• Обеспечение иммунной толерантности,

• предотвращение отторжения плода

Влияние GM-CSF на развитие эмбриона

Увеличение общего числа клеток в бластоцисте

Увеличение числа клеток внутренней клеточной массы

Снижение уровня апоптоза (Robertson et al.,2001)

Экспрессия GM-CSF в репродуктивном тракте женщины

• Экспрессия GM-CSF в период овуляции регулируется эстрогенами

• Попадание семенной жидкости в репродуктивный тракт вызывает резкое увеличение уровня экспрессии GM-CSF и провоспалительных цитокинов клетками эндометрия

• Второй пик экспрессии GM-CSF наблюдается в период имплантации

• После имплантации GM-CSF экспрессируется в клетках трофобласта, децидуальной ткани и плаценты

GM-CSF и нарушения фертильности у женщин

• Уровень экспрессии GM-CSF клетками эндометрия коррелирует с исходом цикла ЭКО (Spandorfer et al., 2008)

• У женщин с бесплодием неясного генеза снижена концентрация GM-CSF в фолликулярной жидкости (Calogeroet et al.,2008)

• В небольшой группе женщин с привычным невынашиванием беременности снижена экспрессия мРНК GM-CSF в эндометрии (Jasper et al., 2007)

IVM

Дозревание яйцеклеток вне женского организма

Особенности:

1. Поиск незрелых яйцеклеток

2. Этап дозревания яйцеклеток

3. Оплодотворение – ИКСИ

4. Проведение вспомогательного хетчинга

перед переносом эмбрионов

PGD

Особенности:

1. На 3 сутки у эмбриона забирается 1 бластомер для анализа

2. Фиксация, окраска и осмотр (FISH – анализ)

Показания:

1. Привычное невынашивание

2. Риск рождения ребенка с наследственными заболеваниями

Преимплантационная генетическая диагностика CGH

• Метод сравнительной геномной гибридизации

• Высокая точность выявления хромосомных патологий (числовые и структурные аномалии хромосом)

• Исследование 23 пар хромосом

Криоконсервация эмбрионов

Позволяет сохранить их для использования в последующих менструальных циклах без проведения стимуляции яичников. Криоконсервированные эмбрионы могут храниться неограниченно долго.

Донорство спермы

Показания:

1. Отсутствие полового партнера

2. Отсутствие сперматозоидов у партнера

3. Тяжелые нарушения сперматогенеза

4. Неблагоприятный генетический прогноз потомства при использовании сперматозоидов партнера

5. Иммунный конфликт

Донорство яйцеклеток

Показания:

1. Отсутствие яичников

2. Истощение яичников

3. Неблагоприятный генетический прогноз потомства при использовании яйцеклеток супруги

Новые направления ВРТ

• Криоконсервация ооцитов и яичниковой ткани для аутотрансплантации и реализации гормональной и репродуктивной функции женщины

• ПГД клеток трофэктодермы и полярного тельца

• Создание криобанка долгосрочного хранения спермы, ооцитов и донорских эмбрионов

• Ко-культивирование эмбрионов на клетках эндометрия