2. Периоды репликации.

Как мы отмечали ранее, для репликации (как и для всякого матричного процесса) характерны три периода.

1. Инициация.

2. Элонгация.

3. Терминация

2.1. Инициация

Репликация начинается в нескольких точках молекулы ДНК. Это связано с тем, что размер генома типичной клетки млекопитающих составляет около 10⁹пар нуклеотидов (п.н.). В ДНК средней по величине хромосомы человека содержится несколько десятков миллионов п.н. При скорости репликации примерно1000 пар нуклеотидов в минутудля полного завершения репликации молекулы ДНК в хромосоме понадобится несколько суток. Для клетки такой срок репликации генома совершенно не приемлем, т.к. во время репликации ДНК на осуществляется важный процесс - транскрипция РНК. Оба процесса – синтез ДНК и РНК, с их громоздким ферментативным обеспечением, одновременно на матрице происходить не могут. Поэтому в момент репликации происходит частичное выключение транскрипции. Это само по себе опасно, т.к. отсутствие экспрессии генов приводит к недостатку белков-ферментов, и, следовательно, к нарушению нормального течения метаболизма. Этот опасный для клетки момент в какой-то мере нивелируется тем, что в период предсинтеза ДНК в цитоплазме клетки заранее накапливается достаточно материала (например, всех видов РНК) для поддержания экспрессии генов в период репликации ДНК на необходимом для жизнедеятельности клетке уровне. Поэтому во время синтеза ДНК трансляция осуществляется (хотя и не в полном объёме), транскрипция же практически не идёт. Понятно, что в этих условиях необходимы механизмы, которые до предела сократили бы время репликации ДНК хромосом. Один из таких механизмов, созданный в эволюции, достаточно прост – репликация начинается одновременно в нескольких точках молекулы ДНК. Приблизительные расчёты показали, что в молекуле ДНК одной хромосомы таких точек может быть донескольких тысяч.Такое большое количество мест, с которых начинается репликация ДНК хромосомы, несомненно, существенно сокращает время её синтеза. Точки, в которых начинается репликация, носят названиеточки начала репликации (т.н.р.) или ориджин, ори – сайт (от англ.origin– начало). Эти точки представляют собой небольшие участки ДНК с определённой специфической последовательностью нуклеотидов. Начальным моментом репликации является присоединение к ори-сайтам специальных белков –инициаторных белков.

Рассмотрим два положения касающихся ори-сайтов. Во-первых, репликация начинается не со всех точек одновременно. В одних точках она может пройти значительный участок, а в других только начаться. Во-вторых, от ори-сайтов процесс синтеза ДНК может двигаться в одном направлении или в сразу в обоих, противоположных направлениях – двунаправленная репликация (см. рис. 34). У эукариот чаще всего наблюдается второй тип репликации.

Наличие ори-сайтов привело к созданию понятия репликон. Репликон это фрагмент матричной ДНК на котором идёт автономный синтез дочерней ДНК. Он начинается с точки начала репликации и заканчивается отточкой, где фермент заканчивает репликацию.

Е

ДНК А Г Д

Б В

Рис. 36. Схема расположения точек начала репликации. Стрелками обозначено направление синтеза ДНК от т.н.р.

У репликона три основных свойства:

а) Он автономен.

б) Обеспечивает процесс синтеза ДНК.

в) Имеет собственное ферментативное обеспечение.

Если репликация однонаправлена, то протяжённость репликона соответствует промежутку между ори-сайтами., например репликон Б – В. Если же репликация двунаправлена (например между ори-сайтами Г – Д), то между этими точками будут располагаться два репликона Г – Е и Д – Е, где точка Е – конец двух различных процессов репликации имеющих собственное ферментативное обеспечение. Как показали эксперименты, определить среднюю протяжённость одного репликона достаточно трудно. Чаще всего за репликон принимают последовательность ДНК, ограниченную двумя ори-сайтами (см. рис.36 ).

В точке начала репликации происходят, события которые связаны с присоединением к инициаторному белку других ферментов запускающих целый ряд подготовительных процессов. В соответствии с очерёдностью эти события располагаются в следующем порядке.

1. Образование репликационной вилки.

2. Образование РНК-затравки

а. Образование репликационной вилки.

Образование репликационной вилки происходит в точках начала репликации. Вилка репликации представляет собой отошедшие друг от друга свободные нити матричной ДНК, на которых происходит синтез дочерних нитей ДНК. Схема образования вилок репликации представлена на рис. 37. Две вилки репликации образуют глазок репликации. В обоих вилках репликации происходит синтез ДНК в противоположных направлениях. В глазке репликации вилки двигаются, расплетая ДНК в противоположных направлениях.

Образованию вилок репликации предшествует целый ряд подготовительных процессов, которые, как правило, располагаются в следующем порядке.

• Освобождение молекулы ДНК от связи с гистонами в нуклеосоме.

• Деспирализация ДНК.

• Разрыв водородных связей между нитями матричной ДНК.

• Расхождение нитей ДНК.

• Фиксация матричных нитей ДНК .

Освобождение молекулы ДНК от связи с гистонами необходимый элемент периода инициации. В ядре клеток ДНК практически никогда не находится в свободном состоянии. Она связана с гистоновыми белками тетрамера и гистоном Н1. Кроме того, с ДНК взаимодействуют различные негистоновые белки, двухвалентные металлы, липиды и др. соединения. Всё это приводит к сильной спирализации отдельных участков ДНК в предсинтетическом периоде.

Каким образом происходит освобождение ДНК от связей с окружающими молекулами до конца не ясно. Однако известно, что в основе этого процесса лежат несколько химических реакций осуществляемых ферментами – метилирование, ацетилирование и фосфорилирование положительно заряженных групп гистоновых и негистоновых белков. В результате белки теряют положительный заряд, их связи с отрицательно заряженной молекулой ДНК становятся слабыми. Это способствует высвобождению ДНК.

Сразу же после освобождения от связей с белком (или параллельно с этим) происходит процесс деспирализации ДНК . Этот процесс необходим для последующего освобождения нитей ДНК от связи друг с другом. Важное значение имеет и другой процесс. Нити молекулы ДНК не просто лежат параллельно друг другу, они взаимно закручены (см. рис. 38).

Существует множество способов раскрутки спиралей. Наиболее часто употребляемые способы показаны на рисунке 39. Очевидно, что способ А не совсем удобен, т.к. при фиксации одного конца и разведение противоположных концов создаются дополнительные силы, приводящие к формированию вторичных суперспиралей. При втором способе ( противоположный конец свободен) раскручивание приведёт к вращению свободного конец, а это может превратить ядро в субмолекулярный миксер, что не безопасно для клетки.

Ори-сайт

ДНК ●

ДНК

ДНК

Репликативный глазок (состоит из двух репликативных вилок)

ДНК

Левая вилка Правая вилка

Д в е р е п л и к а ц и о н н ы е в и л к и

Рис. 37. Схема образования репликационных вилок в точке начала репликации. Пунктирными стрелками показано направление движения вилок.

Рис. 38. Схема взаимного расположения нитей ДНК. Водородные связи между нитями не показаны.

Для их раскручивания используются ферменты, которые осуществляют разрезание, вращение и воссоединение нитей.

Принцип раскручивания спирали ДНК до конца не ясен. Один из возможных вариантов показан на рис. 40. Суть его в том, что специальный фермент производит временный одноцепочечный разрыв в одной нити ДНК. И через этот разрез проходит (протаскивается) противоположная нить ДНК. При этом один виток спирали распрямляется. Затем разрез ликвидируется.

Процесс разрезания, расплетения и сшивки может повторяться множество раз по мере продвижения репликационной вилки по молекуле ДНК.

Все реакции, связанные с раскручиванием нитей ДНК - осуществляют ферменты топоизомеразы. Уместно отметить, что аналогичным образом действуют эти ферменты и про другом процессе – транскрипции.

Следует отметить, что одновременно специальные ферменты (хеликаза) разрывают водородные связи между оппозитными (противоположными) нитями ДНК делая их свободными.

А

Б

Рис. 39. Способы раскручивания верёвки. А – противоположный конец фиксирован. Б – противоположный конец свободен.

Однако освобождённые из дуплекса нити ДНК долго оставаться в свободном состоянии не могут. Они или вновь соединяются или взаимодействуют с активными реагентами из окружающего пространства, или формируют шпильки. Любой вариант способен нарушить нормальный ход репликации. Для предотвращения этого существуют специальные белки – SSB-белки.Эти белки обладают сродством к одноцепочечной ДНК и с появлением последней сразу же соединяются с ней на всём её протяжении, составляя жёсткий каркас, препятствуя не только её реакциям, но и образованию шпилек (Рис. 43, 1).

Важным свойством этих белков является то, что они оставляют открытыми для реакций нуклеиновые основания одноцепочечной нити ДНК, что чрезвычайно важно для последующего синтеза дочерних нитей ДНК.

Разрез в нити № 2 и протягивание через разрез нити № 1

1

А

Б 2

2

В

1

Г

Д

Рис. 40. Схема деспирализации отрезка молекулы ДНК путём разрезания одной нити, протаскивания другой, раскручивания и сшивки разреза после деспирализации участка. Водородные связи между нитями не показаны.

б. Образование РНК-затравки.

После завершения всех вышеперечисленных процессов репликативная вилка почти готова к синтезу ДНК и выглядит как показано на рисунке 41, 1. Однако для полной готовности ДНК к репликации не хватает одной существенной детали. Синтез дочерних нитей в соответствии с матричными свободными нитями ДНК осуществляет фермент ДНК-полимераза.Однаконачатьпроцесс синтеза новой нити этот ферментне может. Он способен толькопродолжитьсинтез уже начатой цепочки. Поэтому другой ферментДНК зависимаяРНК-полимераза(ДНК-праймаза) вначале синтезирует на обоих, разошедшихся в репликационной вилке матричных нитях ДНК, небольшой участок РНК. Эта РНК носит название РНК-затравка (РНК-праймер или просто праймер) (на рисунке 41 они обозначены буквами А и Б). РНК-затравки синтезируются параллельно матричным нитям ДНК по принципу комплементарности. Причём на одной нити, РНК-затравка (на рис. 41 она обозначена как “А”) синтезируется начиная сori-сайта в сторону вилки репликации, на оппозитной нити РНК-затравка (на рис 41 она обозначена как “Б”) синтезируется отступя отori-сайта в его сторону. Синтезом двух РНК-затравок на двух противоположных нитях матричной ДНК заканчивается период инициации.