2. Общее представление о транскрипции.

Экспрессия гена – это реализация генетической информации, закодированной в ДНК, путём её транскрипции и трансляции.Транскрипция – первый этап экспрессии генов. Заключается она в переводе информации, содержащейся в гене на РНК путём синтеза последней на одной нити ДНК гена. В результате транскрипции синтезируются все виды РНК – информационная (иРНК), рибосомальная (рРНК), транспортная (тРНК) и другие (регуляторные, малые ядерные и пр.). Все они принимают участие в экспрессии генов, но только иРНК переносит информацию о строении белка с нуклеотидного «текста» ДНК на аминокислотный «текст» белка. Все остальные виды РНК обеспечивают эффективное осуществление этого процесса.

Суть транскрипции заключается в следующем: специальные ферменты подготавливают молекулу ДНК в области гена к транскрипции (раскручивают спираль ДНК, разрывают водородные связи между нитями и т.д.). Фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза синтезирует РНК на матричной нити ДНК от стартовой точки до точки окончания транскрипции. Синтез РНК заключается в последовательном наращивании в ней нуклеотидов комплементарных матричной нити ДНК. Исключение составляет урацил РНК, который вставляется против аденина матричной нити ДНК.

В транскрипции принимают участие множество ферментов, но непосредственно синтез РНК осуществляет фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза (или просто РНК-полимераза). У прокариот все виды РНК (иРНК, рРНК, тРНК) синтезируются одной РНК-полимеразой, а у эукариот они синтезируются тремя разными ферментами: РНК-полимеразойI, РНК-полимеразойIIи РНК-полимеразойIII.

Информационные РНК у эукариот транскрибируются РНК-полимеразой II.

Транскрипция это сложный многоэтапный процесс и одна РНК-полимераза не в состоянии полностью обеспечить его. На разных этапах транскрипции к РНК-полимеразе присоединяются и, наоборот, отщепляются различные белковые субъединицы, которые модифицируют её активность в соответствии с требованиями данного этапа.

Транскрипция, как и все процессы матричного синтеза у про- и эукариот, состоит из трёх этапов – инициации, элонгации и терминации. В дальнейшем процесс транскрипции будем рассматривать только у эукариот Рассмотрим самый первый этап транскрипции.

3. Периоды транскрипции.

а. Инициация.

Инициация – это подготовительный этап. У про- и эукариот в этой стадии происходят множество синхронизированных во времени процессов. Рассмотрим два из них.

1. Формирование инициаторного комплекса.

2. Образование «транскрипционного глазка».

У про- и эукариот формирование инициаторного комплекса происходит на промоторе. Сама РНК-полимераза, как правило, не может связаться с промотором. Поэтому вначале специальный белок взаимодействует со специфической областью на промоторе. В этой области располагается определённая последовательность нуклеотидов. Она различна у про- и эукариот. У прокариот эта последовательность носит названиебокс Прибнова. У эукариот в специфической области промотора довольно часто встречается следующая последовательность нуклеотидов – ТАТА. Отсюда и название этого участка промотора –ТАТА-бокс. К специальному белку, осевшему на промоторе, присоединяется РНК-полимераза и целый ряд других белков, которые участвуют в подготовке синтеза РНК. Т. обр. на первом этапе на промоторе формируется сложный комплекс, который состоит специального белка осевшего на промотор, РНК-полимеразы и нескольких белков (у эукариот их больше), которые носят названиетранскрипционные факторы (ТФ). Их несколько – ТФ1, ТФ2 ТФ3 и т.д.(рис. 53). У эукариот этих факторов намного больше, чем у прокариот. Совокупность состоящая из специального белка, транскрипционных факторов и РНК-полимеразы носит названиеинициаторный комплекс. После его образования начинаетсяформирование вилки транскрипции. Ферменты комплекса (ТФ1,ТФ2 и др.)раскручиваютспираль ДНК,разрываютводородные связи между нитями. Нити расходятся. В результате формируетсятранскрипционный «глазок»с вилкой транскрипции. Разошедшие нити этой вилки прочно фиксируются специальными белками (SSB), которые могут не входить в инициаторный комплекс (рис. 54).

РНК-полимераза

ТФ ТФ

Специальный белок

Промотор

Инициаторный комплекс

Промотор

Т А Т А

Рис. 53. Присоединение РНК-полимеразы и транскрипционных факторов к ТАТА-боксу промотора у эукариот.

Транскрипционный «глазок»

Белки фиксирующие

разошедшие нити

5’ Смысловая нить 3’

3’ Матричная нить 5’

5’

РНК-полимераза и

РНК белки

Рис. 54. Транскрипционный «глазок».

У прокариот инициаторный комплекс, состоит примерно из пяти субъединиц-полипептидов и называется голофермент (холофермент). В комплексе имеется сигма-субъединица (СС) или сигма-фактор. Это не постоянная единица комплекса. Она может выходить из комплекса, тогда комплекс называется кор-фермент и вновь входить в него. Функция СС заключается в том, что он первый связывается с промотором, затем к нему присоединяется кор-фермент. Без СС кор-фермент практически не взаимодействует с промотором (или взаимодействует очень слабо). Другая функция СС заключается в том, что этот белок приводит к стойким изменениям в структуре других полипептидов комплекса, в результате чего голофермент приобретает способность раскручивать спираль ДНК, разрывать водородные связи между нитями ДНК т.е.формировать вилку транскрипции. СС находится в голоферменте только на этапе инициации. Обеспечив связывание комплекса с промотором, она через некоторое время после начала транскрипции покидает комплекс и присоединяется к новым кор-ферментам (см. далее).

+ =

Рис. 55. РНК-полимераза в зависимости от присоединения к ней сигма субъединицы будет иметь различную структуру и функцию.

У эукариот инициаторный комплекс более сложный, чем у прокариот. Помимо фермента РНК-полимеразы в него входят более 10 полипептидных субъединиц. У них различная функция. Часть из них, также как и СС прокариот, связываются с промотором. Затем на них осаждается РНК-полимераза. Другие субъединицы участвуют в формировании вилки транскрипции и т.д.

Следует отметить, что фермент РНК-полимераза про- и эукариот имеет активный центр, который контролирует связывание нуклеотидов первичного транскрипта между собой. В случае его блокады активность фермента падает. Некоторые антибиотики, например рифампицин и его производные подавляют инициацию транскрипции специфически связываясь с активным центром в РНК-полимеразе. Интересно то, что некоторые бактерии оказались не чувствительны к антибиотику. Исследования показали, что у таких бактерий РНК-полимераза имеет небольшое изменение в структуре. Это изменение не мешает синтезировать олигонуклеотид, но не даёт возможности соединиться с активным центром антибиотику.

После образования транскрипционного глазка начинается следующий этап синтеза РНК – элонгация.

б. Элонгация.

Чаще всего начинается с присоединения к транскрипционному комплексу специальных белков – факторов элонгации, которые запускают процесс синтеза РНК. Точка на ДНК , где начинается синтез РНК называется стартовой точкой.

РНК-полимераза вместе с белками двигается по нити ДНК последовательно раскручивая спираль ДНК. После синтеза РНК нити ДНК вновь конденсируются. Деконденсированной (свободной) в транскрипционном глазке находится нить ДНК протяженностью около 20 нуклеотидов. Синтез молекулы РНК идёт от 5^’конца синтезированной РНК к 3^’её концу. Т.е. при репликации (синтез ДНК) и при транскрипции наращивание новых нуклеотидов идёт с 3^’конца синтезируемой цепи ДНК или РНК. Нить ДНК, на которой синтезируется РНК, называется плюс (+) нитью, кодогенной, антисмысловой, матричной цепью (рис. 56). Скорость синтеза РНК – примерно 30 нуклеотидов в секунду.

РНК-полимераза Вилка транскрипции Терминатор

Белок

Направление синтеза

Промотор

5^’ конец РНК 3^’конец РНК

Рис. 56. Элонгация.

Как правило, у прокариот для всех генов одной хромосомы матричной является одна и та же цепь ДНК. У эукариот матричными могут быть обе нити ДНК.

в. Терминация.

Несмотря на многочисленные исследования последнего этапа транскрипции ясного представления о его механизме пока не получено. Если обобщить имеющиеся, то можно сделать вывод что у большинства про- и эукариот терминация осуществляется несколькими способами. Сущность их одна – в зоне терминатора располагаются специальные элементы, которые останавливают транскрипцию. Таких элементов в настоящее время найдено несколько. Назовём только наиболее исследованные. Их три.

1. В зоне терминации располагается область богатая ГЦ парами.

Химические связи этих нуклеотидов с комплементарными нуклеотидами в транскрипте существенно слабее , чем связи АТ. Это облегчает отрыв синтезированной РНК от ДНК.

2. В терминаторе имеются «шпильки ДНК».

Другой механизм, связан с имеющимися в области терминатора последовательностями нуклеотидов, которые носят название – нвертированные повторы (см. рис. 57, А). Это два участка молекулы ДНК, следующие друг за другом, имеющие одинаковую последовательность нуклеотидов, но расположенные в противоположной (обратной) ориентации. Так например, последовательности, представленные на рисунке 57 (А), являются инвертированными, так как при их чтении от 5’ к 3’ концу она идентична в обоих цепях. Такое расположение нуклеотидов в ДНК терминатора приводит к тому, что при их считывании на РНК образуются участки с комплементарными последовательностями нуклеотидов (рис. 57, Б). Последние соединяются между собой и формируют, фигуру, которая носит название «шпилька» (см. рис. 57, В). Эта шпилька, сформированная на пути РНК-полимеразы, прекращает её движение. В некоторых случаях «шпильку» распознаёт специальный белок, который движется по вновь синтезированной цепочки РНК вслед за РНК-полимеразой. Обнаружив шпильку, белок прекращает движение РНК-полимераза.

У прокариотов инвертированные повторы обнаруживаются практически в каждом терминаторе. В последнее время появились данные о более сложных механизмах терминации транскрипции у эукариот.

3. Бессмысленные (нонсенс) кодоны. Они не кодируют никакую аминокислоту. Предполагают, что опознав их РНК-полимераза прекращает синтез РНК.

Последовательность нуклеотидов в ДНК, которая находится между стартовой точкой и терминатором называется единицей транскрипции. Транскрибируется, как правило, одна из двух цепей ДНК. Могут, но редко транскрибироваться обе цепи одного гена.

Формирующаяся РНК на нити ДНК носит название транскрипт или РНК-транскрипт.