21
ПРАКТИЧЕСКИЕ НАВЫКИ
1. Центральная догма молекулярной биологии Френсиса Крика
Основными звеньями центральной догмы молекулярной биологии, сформулированной Френсисом Криком в 1958 году, являются:
-генетический код (64 кодона),
-антипараллельные (смысловая и антисмысловая) нити ДНК,
-комплементарность мРНК антисмысловой нити,
-антикодон тРНК, распознающий кодон мРНК,
-20 аминокислот, где каждая имеет свою тРНК.
Согласно догме реализация наследственной информации происхо-
дит в направлении: ДНК → мРНК → белок, что является универсальным механизмом экспрессии гена для всех эукариот (рис. 1-9).
Рис. 1-9. Центральная догма молекулярной биологии [из: Fire A. Z., Mello C. C., 2006].
22
Решите ситуационные задачи, основываясь на центральной биологической догме Френсиса Крика.
1. Найдите триплеты ДНК, мРНК, антикодон тРНК. Какую аминокислоту транспортирует эта тРНК?
ДНК |
5' -……..АЦГ……..-3' |
|
3'-………???....…...-5' |
мРНК |
5'-………??? ..…....-3' |
антикодон тРНК |
3'-???-5' |
аминокислота |
? |
2. Найдите триплеты ДНК, мРНК, антикодон тРНК.
ДНК 5'-……???…….-3' 3'-……???…….-5'
мРНК 5'-…...??? …....-3'
антикодон тРНК 3'-???-5'
аминокислота метионин
3. Проанализируйте фрагменты молекул, определите их название, обоснуйте ваш выбор. Существует ли взаимосвязь между представленными фрагментами молекул?
(1)ГЦЦ-ААУ-ЦУГ-УГГ-ГУЦ-АЦГ-ЦЦА
(2)ЦГГ-ТТА-ГАЦ-АЦЦ-ЦАГ-ТГЦ-ГГТ
(3)ала-иле-лей-три-фен-тре-про
4. МолекулатРНК имеет антикодон УГЦ. Какую аминокислотутранспортирует в рибосому эта тРНК?
5. В биосинтезе полипептида участвуют молекулы тРНК с антикодонами УГА, АУГ, АГУ, ГГЦ. Определитенуклеотидную последовательность смысловой цепи ДНК, последовательность мРНК и аминокислотную последовательность полипептида. Установите число нуклеотидов, содержащих аденин (А), гуанин (Г), тимин (Т), цитозин (Ц) в двухцепочечной молекуле ДНК.
23
2. МИКРОПРЕПАРАТЫ. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ТЕРМИНАЛЬНОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КЛЕТКИ
1. Иммуногистохимическое выявление холинацетилтрансферазы в двигательный нейронах спинного мозга.
Мотонейроны спинного мозга принадлежат к популяции холинэргических нервных клеток. Синтез ацетилхолина (АХ) происходит в нервной терминали из холина и ацетил-КоА при помощи фермента хо- лин-ацетилтрансферазы (ХАТ). Снижение экспрессии ХАТ в мотонейронах спинного мозга показано при нейродегенеративных заболеваниях (например, боковой амиотрофический склероз, хорея Хантингтона), одним из патогномоничных признаков которых является прогрессирующая мышечная слабость. Мутация гена, кодирующего ХАТ, обуславливает развитие миастенического синдрома, который также характеризуется внезапными эпизодическими кризами мышечной слабости.
Иммуногистохимическое окрашивание. На поперечных срезах поясничного отдела спинного мозга крысы ХАТ выявлена иммунопероксидазным методом. Антитела (АТ) к ХАТ (Chemicon International, Inc., Temecula, CA) применяли в разведении 1:500. Для иммунной реакции с первичными АТ был применён стрептавидин-биотиновый комплекс (Elite ABC Kit; Vector Laboratories). Иммунопреципитат визуализировали при помощи диаминбензидина (DAB Substrate Kit for Peroxidase; Vector Laboratories). Иммуногистохимическое исследование сегментов спинного мозга на уровне L4–L5 выявило холинэргические нейроны в передних рогах спинного мозга крыс. Осадок иммуногистохимической реакции коричневого цвета локализуется в перикарионе и отростках двигательных нейронов.
2. Иммуногистохимическое выявление быстрого миозина в мышечных волокнах быстрой и медленной скелетной мышцы.
Скорость сокращения мышечного волокна определяется типом миозина. Изоформа миозина, обеспечивающая высокую скорость сокращения, — быстрый миозин, изоформа миозина с меньшей скоростью сокращения — медленный миозин. Общепринято, что волокна, типируемые по быстрому миозину, имеют высокую активность АТФазы миозина и относятся к волокнам типа II. Мышечные волокна, экспрессирующие медленный миозин, классифицируются как волокна типа I с низкой активностью АТФазы миозина. Таким образом, иммуногистохимическое типирование волокон по качественному составу миозина и
24
выявление активности АТФазы миозина отражают скоростные характеристики мышечных волокон.
Иммуногистохимическое типирование быстрой и медленной мышц морской свинки. Криостатные срезы готовили из свежезамороженной в жидком азоте мышечной ткани. Для окрашивания срезов применены антитела к тяжёлым цепям быстрого миозина (Sigma) в разведении 1:400. Дляиммунной реакции с первичными АТбыл применён стреп- тавидин-биотиновый комплекс.Иммунопреципитат визуализировали при помощи диаминбензидина. Срезы камбаловидной (медленной) мышцы морской свинки монтировалина одном предметном стекле вместе со срезами подошвенной (быстрой) мышцы. При окрашивании таких срезов с помощью АТ против тяжёлых цепей быстрого миозина положительная иммуногистохимическая реакция выявлена в быстрых волокнах подошвенной мышцы и отсутствует в гомогенно медленной камбаловидной мышце. Анализ иммуногистохимической реакции указывает, что в медленной мышце отсутствует экспрессия гена тяжёлых цепей быстрого миозина. В быстрой мышце ген быстрого миозина экспрессируется в быстрых мышечных волокнах и отсутствует в медленных. Таким образом, каждая мышца уникальна по спектру входящих в её состав типов мышечных волокон. Этот спектр генетически детерминирован (отсюда практика типирования мышечных волокон при отборе спортсменов-бе- гунов — спринтеров и стайеров). У бегунов-стайеров преобладают медленные волокна, у бегунов-спринтеров — быстрые.
3. СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ С ОТВЕТАМИ И ПОЯСНЕНИЯМИ
1. Молекулярный вес аминокислотных остатков, входящих в состав белка, равен в среднем 110 Да, а нуклеотидных остатков ДНК – около 330 Да. Чему равна молекулярная масса фрагмента двухцепочечной вирусной ДНК, кодирующего белок с общей молекулярной массой 330 кДа?
Решение: Общая молекулярная масса белков равна 330 кДа, что соответствует 330000 Да. Если одна аминокислота, в составе белка в среднем весит 110 Да, то 330000/ 110 = 3000 – это количество всех аминокислотных остатков.
Так как генетический код триплетен, то количество нуклеотидов в мРНК, шифрующей данный белок, будет: 3000 х 3 = 9000.
Так как в ДНК, с которой транскрибировалась мРНК две цепи, то количество нуклеотидов ДНК будет 9000 х 2 = 18000.
25
Если молекулярная масса одного нуклеотида в ДНК около 330 Да, то общая молекулярная масса будет: 18000 х 330 = 5940000 Да.
Ответ: молекулярная масса фрагмента двухцепочечной вирусной ДНК равна 5940000 Да
2. Фермент триптофансинтетаза синтезирует аминокислоту триптофан. Этот фермент состоит из двух пар субъединиц: 2α2β. Молекулярная масса субъединицы α равна 29500 Да, а β — 95000 Да. Какова молекулярная масса всейтриптофансинтетазы? Сколько приблизительно аминокислотных остатков входит в состав этого фермента, если известно, что молекулярная масса одного аминокислотного остатка составляет в среднем 110 Да?
Ответ: (2 х 29500 + 2 х 95000) / 110 = 2490 аминокислот входит в состав триптофансинтетазы.
3. Белок состоит из 100 аминокислот. Установите, во сколько раз молекулярная масса участка гена, кодирующего данный белок, превышает молекулярную массу белка, если средняя молекулярная масса аминокислотного остатка – 110 Да, а нуклеотида – 330 Да. Ответ поясните.
Ответ: 100 х 110 = 11000 – молекулярная масса белка; 100 х 3 = 300 х 2 = 600 х 330 = 198000 – молекулярная масса гена,
кодирующего данный белок; 198000/11000 ~ в 18 раз ген тяжелее кодируемого им белка.
4. Какова молекулярная масса белка, содержащего 99 пептидных связей, при условии, что молекулярная масса одного аминокислотного остатка составляет в среднем 110 Да?
Ответ: 99 пептидных связей в белке образуется между 100 аминокислотами. Тогда молекулярная масса белка будет равна - 100 х 110 =
11000 Да.
5. Небольшой пептид состоит из 40 аминокислотныхостатков. Сколько пар нуклеотидных остатков входит в состав фрагмента двухцепочечной молекулы ДНК, несущего информацию о первичной структуре этого белка?
Ответ: 40 х 3 = 120 х 2 = 240 нуклеотидных остатков двухцепочечной молекулы ДНК.
26
6. Сколько разных пептидов, состоящих из 5 аминокислотных остатков, может быть синтезировано из аминокислот 20 видов, при условии, что каждая из них встречается в синтезируемом белке только один раз?
Ответ: Так как аминокислота встречается в пептиде из 5 аминокислотных остатков всего один раз, а общее число видов их в клетке 20, то
-20 х 19 х 18 х 17 х 16 = 1860480 пептидов.
7.В трансляции участвовало 30 молекул тРНК. Определите число аминокислотных остатков, входящих в состав синтезируемого белка, а также число триплетов и нуклеотидов в участке гена, который кодирует этот белок.
Ответ: Одна тРНК переносит одну аминокислоту, поэтому количество аминокислотных остатков, входящих в состав синтезируемого белка, равно 30. Число триплетов мРНК, с которыми взаимодействуют антикодоны тРНК, также равно количеству тРНК – 30. Нуклеотидов в мРНК будет 30 х 3 = 90, т.к. генетический код триплетен. Двухцепочечная ДНК содержит 90 х 2 = 180 нуклеотидов в участке гена, который кодирует этот белок.
8. Сколько нуклеотидов содержит ген (обе цепи ДНК), в котором запрограммирован белок из 500 аминокислот? Какую он имеет длину (расстояние между нуклеотидами в ДНК составляет 0,34 нм)? Какое время понадобится для синтеза этого белка, если скорость передвижения рибосомы по мРНК составляет 6 триплетов в секунду?
Ответ: 500 х 3 = 1500 х 2 = 3000 нуклеотидов содержит ген (обе цепи ДНК), в котором запрограммирован данный белок. Его длина 1500 х 0,34 = 540 нм. На мРНК содержится 500 триплетов, значит, время, которое понадобится для трансляции данной мРНК, примерно равно 500/ 6 = 83 сек или 1 мин и 23 сек.
9. Участок одной из двух цепей молекулы ДНК содержит 300 нуклеотидов с А, 100 с Т, 150 с Г и 200 с Ц. Какое число нуклеотидов с А, Т, Г, Ц содержится в двух цепях молекулы ДНК? Сколько аминокислот должен содержать белок, кодируемый этим участком молекулы ДНК?
27
Ответ: По правилу комплементарности А – Т во второй цепи будет содержаться 100 нуклеотидов с А. Общее количество А в двух цепях будет – 300 + 100 = 400.
Общее количество Т - 100 + 300 = 400. Общее количество Ц – 200 + 150 = 350. Общее количество Г – 150 + 200 = 350.
Белок будет содержать – 300 + 100 + 150 + 200 = 750/ 3 (т.к. ген. код триплетен) = 250 АК.
10. Наследственный материал вируса гепатита D представляет собой молекулу РНК, являющуюся рибозимом. Во время транскрипции она претерпевает редактирование, приводящее к превращению кодона УАГ в УГГ. Объясните, почему после редактирования в ходе трансляции начинает синтезироваться более длинный белок.
Ответ: Кодон УАГ является терминирующим. На нём процесс трансляции заканчивается.
11. Две цепи молекулы ДНК удерживаются друг возле друга водородными связями. Определите число нуклеотидов с аденином, тимином, цитозином и гуанином в молекуле ДНК, в которой 30 нуклеотидов соединяются между собой 2 водородными связями, а 20 нуклеотидов – 3 водородными связями.
Ответ: А и Т соединяются двумя водородными связями, поэтому их по 15 , т.к. 30/2 = 15. Г и Ц соединяются тремя водородными связями – их по 10, т.к. 20/2 = 10.
12. Ген содержит 5 экзонов, которые представляют собой следующие последовательности: 1 – 93, 2 – 36, 3 – 150, 4 – 66, 5 – 48 нуклеотидов. Сколько аминокислотных остатков будет содержать белок, транслированный с мРНК, которая после альтернативного сплайсинга содержит только 1, 2 и 4 экзоны этого гена?
Ответ: Найдем общее количество нуклеотидов мРНК после альтернативного сплайсинга: 93 + 36 + 66 = 135. Так как генетический код триплетен, то количество аминокислотных остатков будет – 135/ 3 = 65.
28
13. Ген содержит 5 экзонов, причем 1 экзон содержит 69 нуклеотидов, 2 – 90, 3 – 123, 4 – 36, 5 – 81. Расположенные между ними интроны а, в, с и д содержат, соответственно, 120, 129, 96 и 303 нуклеотидов. Произошла мутация в одном из интронов и в ходе трансляции образовался белок из 165 аминокислотных остатков. Назовите этот интрон. Объясните ответ.
Ответ: 165 х 3 = 495 – мРНК, кодирующая мутантный белок.
69 + 90 + 123 + 36 + 81 = 399 - мРНК, кодирующая нормальный белок.
495 – 399 = 96 – мутация произошла в третьем интроне – с.
14. Серповидноклеточная анемия – генетическое заболевание, обусловленное заменой одного нуклеотида в кодоне, шифрующем шестую аминокислоту в β-цепи молекулы гемоглобина. Мутация затрагивает участок ЦЦТГАГГ. Существует нуклеаза, которая узнает ЦЦТГАГГ последовательности и расщепляет молекулу ДНК в этих участках. Эта нуклеотидная последовательность изменена в мутантном гене, поэтому нуклеаза не расщепляет ДНК в этом участке. У здоровых людей при проведении диагностической процедуры нуклеаза расщепляет ДНК в трех местах на четыре фрагмента следующей длины: 256, 201, 181 и 88 тысяч пар нуклеотидов. У гомозигот по мутантному аллелю образуется всего три фрагмента длиной 382, 256 и 88 тысяч пар нуклеотидов. Какой из этих трёх фрагментов содержит мутантный участок гена?
Ответ: При сравнении фрагментов у мутантов выявляется фрагмент 382, который отсутствует у здоровых людей. Если взять фрагмент 201 и сложить его с фрагментом 182 у здоровых людей, то получается 382. Это и есть мутантный участок гена.
15. Рестриктазы разрезают молекулуДНК на несколько фрагментов. Имеется рестриктазa EcoR1, она узнает нуклеотидную последовательность
5'-ГААТТЦ-3' 3'-ЦТТААГ-5'
и расщепляет её между А и Г в каждой нуклеотидной цепи сайта рестрикции. На данном участке молекулы ДНК имеется 3 таких сайта рестрикции. Сколько рестрикционных фрагментов образуется после воздействия на ДНК рестриктазой EcoR1? Как они изменятся по количеству и длине, если произойдет мутация в одном из сайтов рестрикции: А заменится на Т?
29
Ответ: По условию рестриктазой EcoR1 разрезают молекулу ДНК в каждом указанном сайте рестрикции. Если таких сайтов три, то образующихся после расщепления рестриктов будет четыре. Если произойдёт мутация в одном из сайтов узнавания, то этот участок ДНК разрезаться не будет и рестриктаза EcoR1 разрежет ДНК только на три рестрикта (т.к. узнает только 2 сайта), а один из образованных рестриктов будет длиннее.
167. Синдром фригильной (ломкой) Х-хромосомы обусловлен доминантной мутацией динамического типа, связанной с увеличением числа копий тринуклеотидного повтора ЦГГ. Увеличение числа копий происходит в ходе редупликации ДНК во время клеточных делений. У здоровых детей и взрослых число копий триплетного повтора варьирует от 6 до 54, а у больных - от 200 до 1800. Анализ ДНК трёх новорождённых показал, что упервого ребенка в указанной области присутствует 350, у второго – 780, а у третьего – 42 ЦГГ-повтора. Кто из детей будет здоров, а кто может заболеть? Кто заболеет в более раннем возрасте?
Ответ: Третий ребёнок здоров, т.к. имеет 42 ЦГГ повтора, а это входит в границу нормы от 6 до 54. Остальные дети могут заболеть, причём второй ребенок – в более раннем возрасте, т.к. содержит наибольшее (780) число повторов.
17. Предположим, что метилированию подвергаются остатки цитозина, расположенных перед гуанином, в одном из участков ДНК. Одна из цепочек этого участка содержит 120 остатков аденина, 30 – гуанина, 80 – цитозина и 70 – тимина. Только 60% всех цитозинов расположены перед гуанином. Сколько метильных групп понадобится для метилирования этого участка ДНК?
Ответ: Г комплементарен Ц. Значит, общее количество гуанина 80 (1-ая цепь) + 30 (2-я цепь) = 110.
Только 60% всех цитозинов распложены перед гуанином. Составляем пропорцию и вычисляем количество метильных групп:- 110 х 60% / 100% = 66.
66 метильных групп понадобится для метилирования этого участка ДНК.
18. Синдром фригильной (ломкой) Х-хромосомы обусловлен доминантной мутацией динамического типа, связанной с увеличением чис-
30
ла копий тринуклеотидного повтора ЦГГ. Увеличение числа копий происходит в ходе редупликации ДНК во время клеточных делений. У здоровых детей и взрослых число копий триплетного повтора варьирует от 6 до 54, а у больных - от 200 до 1800. У больных весь участок гена, содержащий повтор, очень метилирован по цитозину. Сколько метильных групп потребуется для метилирования участка 2-х цепочечной молекулы ДНК, который в своей значащей (смысловой) цепи содержит 300 повторов ЦГГ?
Ответ: 300 Ц в одной цепи, 300 + 300 = 600 Ц во второй цепи, по правилу комплементарности оснований. Всего 900 Ц. Значит, потребуется 900 метильных групп.
19. Вычислите, тяжелее белок или кодирующая часть его гена? Ответ: Предположим, что количество аминокислот в белке-мише-
ни равняется Х, тогда масса этого белка составит 110×Х. Количество нуклеотидов в экзонах гена, кодирующего этот белок, составляет 3Х, а молекулярная масса, следовательно, равняется 330×3Х.
110Х < 330 × 3Х. Кодирующие участки гена тяжелее белка.