иии / мроекулярная биология клетки / Глава 1

21

Работа при большом увеличении (объектив 40х)

К изучению микропрепарата при большом увеличении переходят после его визуализации при малом увеличении. Для этого необходимо проделать следующее.

1.Центрировать микропрепарат. Для этого изучаемое место микропрепарата нужно выставить под малым увеличением в центр поля зрения, поскольку при большом увеличении будет виден лишь центральный участок видимого при малом увеличении микропрепарата. При этом следует помнить, что микроскоп даёт перевёрнутое (обратное) изображение.

2.Слегка приподнять тубус, вращая макровинт на себя.

3.С помощью револьвера заменить объектив малого увеличения (8х) на объектив большего увеличения (40х).

4.Подвизуальным контролем (глядя сбоку) и вращая макровинт от себя, опустить тубус с объективом почти вплотную к препарату, но не до соприкосновения с покровным стеклом.

5.Глядя в окуляр, вращением макровинта на себя очень медленно поднимать тубус до появления изображения. Фокусное расстояние при объективе 40х составляет примерно 1 мм. При слишком быстром вращении винта изображение объекта можно легко пропустить.

6.После появления изображения дальнейшую фокусировку осуществляют микрометрическим винтом, вращая этот винт на пол оборота вперед или назад, но не поворачивая его полностью.

7.Рассмотреть микропрепарат, слегка вращая микровинт влево или вправо. Этим достигается возможность рассмотрения структур на разной глубине объекта, что обусловлено толщиной микропрепарата (среза).

8.После окончания изучения микропрепарата тубус слегка приподнять вверх при помощи макровинта.

9.Объектив 40х заменить на объектив 8х.

10.Снять микропрепарат с предметного столика.

Завершение работы с микроскопом

Закончив микроскопирование, следует проделать следующее.

1.Убрать микропрепарат с предметного столика.

2.Установить объектив с малым увеличением.

3.Вращением макровинта опустить объектив на расстояние до 1–2 см от предметного столика.

4.Держа одной рукой тубусодержатель, а другой поддерживая снизу основание, перенести микроскоп в место его хранения.

22

Проблемы, возникающие при микроскопировании

Часто встречающиеся проблемы, возникающие при самостоятельной работе с микроскопом, и способы их устранения представлены в таблице 1-3.

Таблица 1-3. Возможные проблемы и способы их решения при микроскопировании

23

2. МИКРОПРЕПАРАТЫ. ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ ЯДЕР И ЯДЕРНЫХ СТРУКТУР В РАЗНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ТИПАХ

Клеточная культура фибробластов

Название клетки произошло от лат. fibra — волокно и греч. blastos — зародыш; т.е. клетка, образующая волокна. При изучении микропрепарата под малым увеличением видны плоские отростчатые клетки различной формы (от веретеновидной до звёздчатой) (рис. 1-7). Ядро крупное, овальное формы, имеет базофильное (синее) окрашивание. Базофильный краситель синего цвета связывается с кислотами (ДНК и РНК ядра), окрашивая его. При большем увеличениина фоне преимущественно диспергированного хроматина (эухроматин) хорошо заметны 1–2 ядрышка. Строение ядра фибробласта характерно для клетки с интенсивной синтетической активностью, на что указывает присутствие и других органелл. Цитоплазма содержит в большом количестве цистер-

Рис. 1-7. Строение фибробласта(А) и фиброцита (Б). Фибробласт (активная форма клетки) содержит хорошо выраженные органеллы: гранулярную эндоплазматическую сеть, комплекс Гольджи, митохондрии. Крупное овальное ядро с выраженным ядрышком занимает центральное положениевдоль продольной оси клетки. Фибробласт образует длинные, ветвящиеся отростки. В фиброците тех же органелл значительно меньше, клетка имеет веретеновидную форму; отростков нет [по Junqueira L.C., Carneiro J., 1991].

24

ны гранулярной эндоплазматической сети, хорошо выраженный комплекс Гольджи, многочисленные секреторные гранулы и митохондрии. Фибробласт активно синтезирует белки межклеточного матрикса, например, коллаген для образования коллагеновых волокон.

Мазок крови человека

В мазке крови хорошо различимы: эритроциты (безъядерные клетки, имеющие форму двояковогнутого диска), ядерные шарообразные лейкоциты (лимфоциты, моноциты, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы) и тромбоциты (двояковыпуклые пластинки). При малом увеличении всё поле зрения занимают эритроциты, среди которых встречаются единичные лейкоциты. Для детального изучения клеток крови применяют большое увеличение (рис. 1-8).

Эритроцит. Из-за высокого содержания щелочного белка гемоглобина (Hb) клетка окрашена в розовый цвет кислым красителем (эозинофилия/ацидофилия). Слабое окрашивание центральной части клетки обусловлено формой эритроцита (двояковогнутый диск). Ядро отсутствует.

Лейкоциты

•Лимфоцит. Базофильное ядро сферическое или с небольшой боковой выемкой; преимущественно содержит плотно сконденсированный хроматин. Ядро лимфоцита занимает почти весь объём клетки, так что цитоплазма окружает клетку в виде узкого кольца.

•Нейтрофил. Ядро имеет дольчатое (сегментированное) ядро — 3–5 сегментов, соединённых перемычкой. Базофильные сегменты содержат конденсированный хроматин, расположенный вдоль внутренней ядерной мембраны и эухроматин, занимающий центральную область дольки.

Рис. 1-8. Клетки крови. А — эритроцит; Б — нейтрофил;В — лимфоцит; Г — моноцит [по Lentz T.L., 1971].

25

•Моноцит — самая крупная клетка крови. Базофильное ядро подковообразной (бобовидной) формы расположено эксцентрично, имеет пятнистый вид из-за неравномерно распределённого конденсированного и неконденсированного хроматина.

3. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА. ПОЛОВОЙ ХРОМАТИН

Половой хроматин (тельце Барра) — конденсированный хроматин (гетерохроматин), содержащий ДНК одной из двух Х-хромосом в ядрах клеток женского организма. В медицинской практике при экспресс-ди- агностике половой хроматин определяют в эпителиальных клетках слизистой оболочки щеки или в мазке периферической крови. В ядрах эпителиальных клеток половой хроматин выявляется в виде компактной глыбки хроматина, называемой тельцем Барра. В лейкоцитах периферической крови половой хроматин выявляется в виде «барабанных палочек» — глыбок хроматина, связанных тонкой нитью с ядром клетки. Исследование полового хроматина, кроме половой принадлежности, позволяет также установить аномалии в числе Х-хромосом (рис. 1-9).

Выявление полового хроматина в эпителиальных клетках слизистой оболочки щеки женского организма

•Протокол приготовления микропрепарата.

1.Осторожно несколько раз надкусить слизистую оболочку щеки и тщательно прополоскать рот питьевой водой.

Рис. 1-9. Половой хроматин в ядре эпителиальной клетки слизистой оболочки щеки человека. А — мужчина; Б — женщина; В —

женщина с дополнительной Х-хромосомой (47ХХХ). Овальной формы (0,7–1,2 мкм) тельце Барра локализуется на внутренней ядерной мембране [по Moor K.L., 1977].

26

2.Стерильным шпателем соскоблить эпителий и нанести содержимое соскоба тонким слоем на предметное стекло.

3.До высыхания материала на мазок нанести 1-2 капли гистологического красителя (ацетоорсеина) и накрыть мазок покровным стеклом.

4.Через 5-6 секунд окрашивания краситель удалить.

5.Чтобы удалить краситель, покровное стекло накрыть кусочком фильтровальной бумаги и двумя большими пальцами умеренно надавить на покровное стекло.

6.Центрировать препарат подмалым увеличением. Изучить препарат с помощью иммерсионного объектива.

•При изучении препарата нужно учитывать следующее:

1.клетка должна иметь овальное или округлое, слегка окрашенное ядро;

2.ядерная мембрана должна быть четкой, ненарушенной;

3.ядра не должны перекрывать друг друга;

4.только тёмноокрашенные тельца, находящиеся в контакте с ядерной мембраной, нужно расценивать как половой хроматин, или тельце Бара;

5.исследуют примерно 100 окрашенных ядер. В норме половой хроматин встречается в 30—40% ядер.

•Записать ход работы в рабочей тетради. Зарисовать эпителиальные клетки слизистой оболочки щеки с половым хроматином и без полового хроматина. На рисунках отметить следующее:

1.эпителиальная клетка;

2.ядро;

3.половой хроматин (тельце Барра).

•Сформулировать выводы лабораторной работы и ответить на следующие вопросы:

1.Что представлено в виде глыбки полового хроматина?

2.Почему в клетках мужчин, как правило, тельце Барра отсутствует?

27

ТИПОВЫЕ ТЕСТОВЫЕ ВОПРОСЫ

Пояснение. За каждым из перечисленных вопросов или незаконченных утверждений следуют обозначенные буквой ответы или завершения утверждений. Выберите один ответ или завершение утверждения, наиболее соответствующее каждому случаю.

1.Ядро. Верно всё, КРОМЕ:

(А)обеспечивает хранение и реализацию генетической информации

(Б) кодирующая ДНК занимает 3% от ядерного генома

(В) содержит примерно 22500 генов

(Г) наследственную информацию кодирует смысловая цепь

(Д) ДНК находится в линейной и кольцевой форме

2.Строение ядра. Верно всё, КРОМЕ:

(А)ядерная оболочка образована внутренней и наружной ядерными мембранами и ядерной пластинкой

(Б) в организации ядрышка участвуют петли аутосом

(В) ядерные частицы нуклеоплазмы — ферменты синтезаДНК и РНК

(Г) форма зависит от формы клетки

(Д) половой хроматин конденсированная от из Х-хромосом женского организма

3.Молекула ДНК. Верно всё, КРОМЕ:

(А)состоит из смысловой и антисмысловой спирально закрученных

полинуклеотидных цепей

(Б) антипараллельные цепи полинуклеотидов соединены фосфодиэфирными связями

(В) полинуклеотидная цепь представляет собой биополимер, состоящий из дезоксинуклеотидмонофосфатов

(Г) наследственную информацию кодирует смысловая цепь

(Д)антисмысловая цепь служит матрицей для синтеза мРНК

4.Ядерная пластинка. Верно всё, КРОМЕ:

(А)отделяет внутреннюю ядерную мембрану от содержимого ядра

(Б) состоит из белков промежуточных филаментов — ламинов

(В) участвует в организации ядерной оболочки

(Г) формирует перинуклеарный хроматин

(Д) участвует в синтезе белков, поступающих в перинуклеарные цистерны

5.Комплекс ядерной поры. Верно всё, КРОМЕ:

(А)встроен во внутреннюю ядерную мембрану

(Б) содержит белок-рецептор, контролирующий перенос больших белковых молекул из цитоплазмы в ядро

28

(В) рецептор ядерной поры может увеличивать диаметр канала поры

(Г)образован большими белковыми гранулами, расположенными по окружности вблизи края поры

(Д)большая центральная гранула состоит из СЕ рибосом

6.Нуклеотид ДНК содержит:

(А) рибозу, тимин

(Б) рибозу, урацил, остаток фосфорной кислоты

(В)дезоксирибозу, урацил, остаток фосфорной кислоты

(Г) дезоксирибозу, гуанин

(Д) дезоксирибозу, тимин, остаток фосфорной кислоты

7.Как называется структура, состоящая из 8 гистоновых белков, на которую накручена нить ДНК?

(А) Нуклеосома

(Б) Хроматин

(В)Теломера

(Г)Ядрышко

(Д)Центромера

Пояснение. Каждый из нижеприведённых вопросов содержит четыре варианта ответов, из которых правильными могут быть один или сразу несколько. Выберите:

A — если правильны ответы 1, 2 и 3 Б — если правильны ответы 1 и 3 В — если правильны ответы 2 и 4 Г — если правилен ответ 4

Д — если правильны ответы 1, 2, 3 и 4

8.К световой микроскопии относятся:

(1) лазерная

(2) фазово-контрастная

(3) люминисцентная

(4) темнопольная

9.К пуриновым основаниям относятся:

(1) аденин

(2) тимин

(3) гуанин

(4) цитозин

10.Молекула ДНК состоит из:

(1) нуклеозидмонофосфатов

(2) дезоксинуклеозидтрифосфатов

(3) нуклеозидтрифосфатов

(4) дезоксинуклеозидмонофосфатов

29

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1.Почему препарат кладётся покровным стеклом вверх, а не вниз?

2.Чему равно фокусное расстояние объективов 8х и 40х?

3.Для чего необходимо знать фокусное расстояние объективов?

4.Почему перед наводкой объектива на резкость, опуская объектив на некоторое расстояние от препарата, мы смотрим сбоку на него, а не в окуляр?

5.Когда и с какой целью можно использовать конденсор?

6.Для чего и с какой целью используется диафрагма?

7.Что такое иммерсионное масло и для чего оно используется?

8.Есть ли предел увеличения светооптических микроскопов?

9.Что такое фокусное «расстояние» объективов?

10.Существует ли зависимость фокусного «расстояния» от разрешающей способности объективов?

11.В чем удобство использования стереоскопических микроскопов?

12.Какое основное правило необходимо соблюдать при работе с микрометрическим винтом?

13.Какое правило необходимо соблюдать при работе с револьвером микроскопа при смене объективов?

14.Студент не зафиксировал объектив в гнезде револьвера. Как это отразится на поле зрения микроскопа?

15.С применения какого объектива необходимо начинать работу с микроскопом?

16.Что означает термин «центровка» препарата?

17.Что означает разрешающая способность объектива?

18.Как устроен инвертированный микроскоп?

19.Что такое флуоресцентная микроскопия?

20.В каких случаях применяется контрастная микроскопия?

21.В чём преимущество стереоскопических микроскопов над прямыми световыми?

22.Что такое лазерная конфокальная микроскопия?

23.Какие типы электронных микроскопов вы знаете?

24.Какие особенности изображения можно получить с использованием просвечивающих и сканирующих электронных микроскопов?

25.Из каких молекул синтезируется ДНК?

26.Какими связями соединены полинуклеотидные цепи в двуцепочечной молекуле ДНК?

27.Назовите структурный компонент клетки, в котором образуются рРНК, участвующие в синтезе белка.

28.Назовите структурный компонент клетки, окружённый двумя мемб-

30

ранами; с внутренней мембраной связан хроматин, на наружной мембране локализуются рибосомы.

29.Какой структурный компонент клетки содержит хроматин?

30.Что содержится в нуклеоплазме?

31.Какой сахар входит в состав ДНК и РНК?

32.Чем образован половой хроматин?

33.Дайте определение понятию «хроматин».

34.Что такое «гетерохроматин» и «эухроматин»?

35.Что такое «ядрышковые организаторы»?

36.Что такое «нуклеосома», каково её строение?

37.Назовите две основные функции ядра клетки.

38.Где в клетке происходит синтез рибосомальной РНК?

39.Что такое «комплекс ядерной поры»?

40.Что такое нуклеотид?

41.Каково строение ядрышка ядра?

42.Что такое нуклеозиды?

43.Что такое нуклеоплазма?

44.Чем отличается ДНК от РНК?

45.Назовите виды химических связей, которые принимают участие в формировании полинуклеотиднной цепи.

46.Сформулируйте правило Уотсона-Крика.

47.Сколько хромосом в соматической клетке человека? Сколько хромосом в половой клетке человека?

48.Что такое азотистые основания?

49.Какие клетки человека не имеют ядра?

50.Какая из двух (смысловая или антисмысловая) полинуклеотидных цепей ДНК является матрицей для транскрипции РНК?