иии / мроекулярная биология клетки / Глава3

21

желудочной железы. Это полипотентные клетки, потомки которых дают начало ограниченному количествутипов коммитированных (унипотентных) клеток-предшественниц. К настоящему времени плюрипотентная стволовая клетка взрослого организма, способная дать начало всем клеточным типам организма, не обнаружена.

•Эмбриональные стволовые клетки получают из бластоцисты на 4–5 сутки после оплодотворения яйцеклетки. Полученные клетки культивируют invitro с целью выделения чистой клеточной линии, способной формировать шарообразные скопления — эмбриоидные тела. С помощью специфических факторов роста можно направлять дифференцировку диссоциированных клеток эмбриоидных тел в различные клеточные типы всех трёх зародышевых листков.

•Индуцированные плюрипотентныеклетки(inducedPluripotent Stemcells, iPS–cell) получены путём генетической модификации соматической клетки факторами транскрипции Oct4, Sox2, cMyc и Klf4. Полученные клеткиобладаютсвойствамиэмбриональныхстволовыхклеток.В культуре iPS–клетки спонтанно дифференцируются в производные зародышевой эктодермы, энтодермы и мезодермы. В результате трансплантации iPS–клеток в бластоцистумыши получены живые химеры, способные генерировать половые клетки iPS происхождения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ НАВЫКИ

МИКРОПРЕПАРАТЫ. КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ

1. Фигуры митоза животной клетки

На микропрепарате можно видеть клетки, находящиеся на разных стадиях клеточного цикла и митоза (рис. 3-4).

Профаза. Стадия материнского клубка

При большом увеличении микроскопа среди неделящихся клеток с ядрами бобовидной или овальной формы найти клетку, ядро которой имеет вид клубка, состоящего из интенсивно окрашенных хроматиновых нитей. Происходит конденсация хромосом, состоящих из двух хроматид. Зарисовать делящуюся клетку и отметить материнский клубок.

Метафаза. Стадия материнской звезды

При большом увеличении микроскопа найти клетку, находящуюся в стадии материнской звезды. Хромосомы, расположенные по экватору

22

клетки, имеют вид шпилек, обращенных согнутыми концами к середине клетки, а свободными — к периферии. Каждая хромосома состоит из двух хроматид, соединенных друг с другом в области центромер. Зарисовать делящуюся клетку и отметить материнскую звезду.

Анафаза. Стадия дочерних звёзд

При большом увеличении микроскопа найти клетку, находящуюся в стадии дочерних звёзд. Эту стадию можно узнать по двум небольшим фигурам в виде звёзд, состоящих из расцепившихся и отошедших друг от друга к противоположным полюсам клетки хромосом.

При зарисовке следует обратить внимание на то, что согнутые концы хромосом обращены к полюсам, а свободные — к экватору клетки. Зарисовать делящуюся клетку и отметить дочерние звёзды.

Телофаза. Стадия дочерних клубков

Среди клеток, находящихся в интерфазе, найти делящуюся клетку с двумя маленькими клубочками, состоящими из хроматиновых нитей. Зарисовать делящуюся клетку и отметить дочерние клубочки.

2. МИТОЗ В КЛЕТКАХ КОРЕШКА ЛУКА

Деление клеток происходит в самом кончике корешкалука. При большом увеличении найти делящиеся клетки с хроматиновыми фигурами митоза (рис. 3-7). Зарисовать клетки, находящиеся на различных стадиях деления и отметить интерфазу и фазы митоза.

Рис. 3-7. Митоз растительной клетки.

23

3. МАЗОК КРАСНОГО КОСТНОГО МОЗГА

Преобладают ядерные формы развивающихся клеток крови (рис. 3- 8). Клетки одной линии группируются вместе, образуя гемопоэтические островки.

Нормобласт (оксифильный эритробласт) — предшественник эритроцита, цитоплазма заполнена гемоглобином. Небольшое плотное ядро содержит конденсированный хроматин. На этой стадии эритроидные клетки выталкивают пикнотичное (дегенерирующее) ядро.

Мегакариоцит. Очень крупная клетка содержит полиплоидное дольчатое («лапчатое») ядро. Хроматин распределён диффузно. Характерно наличие псевдоподий. Псевдоподии проникают в просвет капилляров, где от них отделяются тромбоциты (кровяные пластинки).

Белая жировая клетка — крупные округлые клетки. Основной объём клетки занимает вакуоль с нейтральным жиром, окружённая уз-

Рис. 3-8. Мазок красного костного мозга. Гемопоэтические островки разделены кровеносными капиллярами с широким просветом. На микропрепарате под малым увеличением хорошо различимы крупные белые жировые клетки и полиплоидные мегакариоциты. Нормобласт можно легко идентифицировать под большим увеличением. Размер клетки практически такой же, как у эритроцита, цитоплазма имеет розовый цвет, ядро округлой формы тёмно-синего цвета [из Junqueira L.C., Carneiro J., 1991].

24 ким ободком цитоплазмы. Ядро (и прочие органеллы) оттеснено на пе-

риферию и представляется несколько сплющенным.

4. ЭНДОМИТОЗ В КЛЕТКАХ ПЕЧЕНИ

Печень (рис. 3-9) состоит из долек пяти-шестигранной формы. Вцентре дольки находится центральная вена, от которой в радиальном направлении идут тяжи эпителиальных клеток (гепатоцитов). Между тяжами гепатоцитов расположены кровеносные капилляры. Часть гепатоцитов, как результат эндомитоза, содержит по два ядра, которые могут содержать как диплоидный, так и полиплоидный набор хромосом.

Рис.3-9. Печёночная долька. Среди гепатоцитов встречаются двуядерные полиплоидные клетки [из:Junqueira L.C., Carneiro J., 1991].

26

зонд) или коплементарной РНК (РНК-зонд) даёт возможность ответить на вопрос, присутствует или нет в ткани ген-мишень, происходит или нет экспрессия этого гена и установить уровень, на котором она может меняться — транскрипция ДНК, сплайсинг РНК, трансляция. В эксперименте и на практике метод гибридизации in situ применяется, например, для:

•визуализации дифференциальной экспрессии генов в эмбриогенезе и дифференцировке стволовых клеток в постнатальном периоде;

•выявления маркёрных генов опухолевых клеток;

•выявления ДНК или РНК в инфицированной ткани (например, при вирусной, бактериальной, грибковой или протозойной инфекции);

•выявления мутированных генов при наследственных заболеваниях.

2. Протокол хромогенной гибридизации in situ

1.Подготовка биопсийного материала нацелена сохранение как морфологической целостности ткани, так и ДНКили РНК-мишеней. На практике для гибридизации in situ готовят криостатаные срезы из замороженной ткани или парафиновые срезы из фиксированной формалином и пропитанной парафином ткани.

2.Подготовка срезов к гибридизации заключается в демаскировке нуклеиновых кислот. Для демаскировки нуклеиновых кислот проводят ограниченный протеолиз с использованием обычно двух ферментов: протеиназы К и пепсин-HCl. Протеиназуприменяют наиболее часто для демаскировки вирусной ДНК, а пепсин-HCl более подходит для анализа РНК и геномной ДНК.

3.Выбор зонда. Для выявления генетических мутаций в хромосомах применяется ДНК-зонд — фрагменты одноцепочечной ДНК длиной около 20 нуклеотидов, конъюгированные с биотином.

4.Денатурация. Перед гибридизацией, нити двуцепочеченой молекулы ДНК необходимо разделить друг от друга. Это достигается путём нагревания срезов до +95С — +98 С. Время денатурации для замороженных срезов составляет 3-5 мин., а для парафиновых - 6 -10 мин. Во время денатурации срезы необходимо накрыть покровным стеклом для предупреждения высыхания.

5.Гибридизация с ДНК-зондом проводится при +37С в течение 2-3 ч.

6.Отмывка срезов после гибридизации проводится для удаления ДНКзонда, не связавшегося с ДНК-мишенью.

7.Визуализация реакции. Для детекции биотонилированных ДНКзондов срезы инкубируют со стрептавидином, конъюгированным с ферментом (щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена). В ре-

27

зультате гистохимической реакции (выявление активности фермента) в присутствии хромогенного субстрата (диаминобензидина) в месте реакции гибридизации образуется нерастворимый преципитат.

8.Окрашивание препарата гистологическими красителями. Для получения полной морфологической картины ткани, после гибридизации срезы докрашивают стандартными гистологическими красителями, например гематоксилином и эозином.

9.Заключение препарата. Срезы промывают и заключают в водорастворимые среды или канадский бальзам.

10.Интерпретация результатов. Микропрепараты изучают под световым микроскопом. Гибридизационный сигнал представляет собой скопление зёрен коричневого цвета, локализованных в ядре.

3. In situ хромогенная гибридизация протоонкогена erbb2 в эпителиальных клетках молочной железы

Виден проток молочной железы, выстланный нормальным эпителием. В результате комплементарного взаимодействия ДНК-зонда с геном erbb2 на 17 хромосоме в ядрах эпителиальных клеток чётко определяется продукт гибридизации коричневого цвета в виде двух точек (рис. 3-11). Наличие двух меток свидетельствует о присутствии в ядре клеток

Рис. 3-11. Гибридизация протоонкогена erbb2 внормальных эпителиальных клетках протока молочной железы [с препарата проф. Петрова С.В.].

28

нормального количества аллелей этого гена — по одномуаллелю в каждой из двух гомологичных друг другу хромосом диплоидного набора.

4. In situ хромогенная гибридизация онкогена erbb2 в раковых клетках молочной железы

На препарате хорошо видны ядра клеток ракамолочной железы. Они округлой формы и слабо-фиолетового цвета. Вокруг ядер видна бесцветная цитоплазма с еле заметными контурами клеток. В каждом ядре опухолевой клетки видна коричневая зернистость (рис. 3-12). Количество зёрен равно количеству аллелей этого гена. Как правило, количество зёрен превышает норму, равную двум. Превышение числа аллелей сверх нормы свидетельствует о наличии в клетках хромосомных или геномныхмутаций, сопровождающихся увеличением числа аллелей этого гена.

Рис. 3-12. Гибридизация протоонкогена erbb2 в раковых клетках молочной железы [с препарата проф. Петрова С.В.].

29

ТИПОВЫЕ ТЕСТОВЫЕ ВОПРОСЫ

Пояснение. За каждым из перечисленных вопросов или незаконченных утверждений следуют обозначенные буквой ответы или завершения утверждений. Выберите один ответ или завершение утверждения, наиболее соответствующее каждому случаю.

1.В какой фазе клеточного цикла происходит матричный синтез ДНК?

(А) G0

(Б) G1

(В) G2

(Г)S

(Д) M

2.На какой стадии митоза дочерние хромосомы расходятся к полюсам митотического веретена?

(А) Профаза

(Б) Прометафаза

(В) Метафаза

(Г)Анафаза

(Д)Телофаза

3.Как называется тип стволовых клеток, которые обладают потенциалом дать начало всем специализированным клеткам, формирующим ткани эмбриона и обеспечивающим его развитие.

(А) Тотипотентные

(Б) Плюрипотентные

(В) Полипотентные

(Г) Унипотентные

(Д)Все из перечисленных

4.Назовите белок, который является одним из важнейших регуляторов клеточного цикла, специфически связывается с ДНК и активирует экспрессию генов, блокирующих цикл в контрольной точке G1®М в случае возникновения нарушений репликации ДНК.

(А) Белок р53

(Б) Циклины

(В) ras G-белки

(Г) Циклин-зависимые протеинкиназы

(Д)Белок семейства рецепторов эпидермального фактора роста

30

5.Каждая хромосома имеет особый участок, в области которого у большинства эукариот к хромосомам прикрепляются микротрубочки веретена деления. Назовите этот участок хромосомы.

(А)Короткое плечо

(А)Длинное плечо

(А)Первичная перетяжка (центромера)

(А)Вторичная перетяжка

(А)Теломера

Пояснение. Каждый из нижеприведённых вопросов содержит четыре варианта ответов, из которых правильными могут быть один или сразу несколько. Выберите:

A— если правильны ответы 1, 2 и 3 Б — если правильны ответы 1 и 3 В — если правильны ответы 2 и 4 Г — если правилен ответ 4

Д— если правильны ответы 1, 2, 3 и 4

6.В какой фазе клеточного цикла происходит синтез РНК и белка?

(1)G1

(2)M

(3)G2

(4)S

7.Однимиз важнейших компонентов митотического аппарата эукариотической клетки является веретено деления, состоящее из:

(1)миозиновых нитей

(2)микротрубочек

(3)актиновых нитей

(4)моторных белков

8.Для ядра соматические клетки в предсинтетической стадии интерфазы характерно:

(1)диплоидный набор хромосом

(2)ядрышко

(3)рибосомы на наружной мембране ядерной оболочки

(4)каждая хромосома состоит из одной конденсированной хроматиды

9.Индуцированные плюрипотентные клетки:

(1)имеют характеристики эмбриональных стволовых клеток

(2)дают начало клеткам всех трёх зародышевых листков

(3)получают при помощи генетической модификации соматических клеток

(4)для модификации требуются факторы транскрипции