mikra_2

комплиментарного основания 2. Алкилирующие агенты (этилметансульфонат – этилирует атом азота гуанина) – меняется структура основания, что препятствует соединению с комплементарным основанием 3. Интеркалирующие агенты (акридиновые красители) – увеличивают расстояние между основаниями, что приводит к утрате нуклеотидов или включению дополнительной пары нуклеотидов Физические: 1. Ультрафиолетовое излучение (длина волны260 нм) – вызывают образование

димеров тимина, что приводит к нарушению симметрии ДНК и препятствует правильной репликации; 2. Ионизирующее излучение.

7. Репаративные процессы: темновая, световая репарация; механизмы.

Бактерии имеют специальные системы для восстановления повреждённой ДНК – системы репарации.

Механизмы репарации:

1.Световая репарация (фотореактивация). Эта система работает в присутствии солнечного света. Ферменты этой системы узнают повреждённый участок ДНК, активируются в присутствии солнечного света и восстанавливают повреждение.

2.Темновая репарация (эксцизионная – от слова эксцизия - вырезание). Ферменты этой системы узнают повреждение, вырезают повреждённый участок, восстанавливают его.

SOS – репарация – этот механизм запускается, если ДНК имеет множественные повреждения и клетка находится на грани гибели. 1. Образующиеся бреши в ДНК заполняются готовыми фрагментами нуклеотидов. Эта система работает быстро, но совершает много ошибок. Высока вероятность возникновения мутаций. 2. т.о. темновая и световая репарация устраняет повреждения с точность до одного нуклеотида. SOS – репарация быстро устраняет повреждения, с высокой вероятностью образования мутаций, но клетка сохраняет жизнеспособность. 3. В клетках млекопитающих происходят те же механизмы, что и в бактериях 4. Мутации в генах, ответственных за репарацию могут привести к злокачественной трансформации клеток у человека 5. Репаративные процессы играют роль в поддержании постоянства генома.

Механизмы репарации мутаций у бактерий. Осуществляется ферментами. Этапы восстановительного процесса:

-Определение локализации поврежденного участка

-ДНК «Вырезание» поврежденного участка

-На матрице сохранившейся нити ДНК синтезируется новый фрагмент

-Встраивание нового фрагмента в молекулу репарируемой ДНК

8. Практическое использование мутационных процессов в биотехнологии и генной инженерии.

Селекция мутагенов с заданными свойствами. Получение суперпродуцентов, получение рекомбинантов с заданными свойствами. Ген. Инженерия: селекция, методы создания рекомбинантных молекул( метод клонирования генов). Создание штаммовпродуцентов различных БАВ( дрожжи, кишечная палочка). Создание вакцины против гепатита С.

9. Генетические рекомбинации - определение; виды генетических рекомбинаций: трансформация, трансдукция, конъюгация.

Рекомбинация – это обмен генетической информацией, или перестройка генетического материала внутри одного организма или между организмами.

Рекомбинация между геномами.

В результате рекомбинации образуются новые генетические варианты, которые проходят проверку на жизнеспособность при окружающих условиях окружающей среды. Процессы рекомбинации можно разделить на три типа: 1.Общая – между любыми гомологичными участками ДНК 2.Специфическая (сайт-специфическая) – только между участками определённой гомологичной ДНК 3.Незаконная – между любыми, даже не гомологичными участками ДНК, этот тип рекомбинации обеспечивают IS & Tn.

Рекомбинация внутри генома обеспечивается IS & Tn, интегративными плазмидами. Рекомбинация между геномами обеспечивается за счёт конъюгации. трансформации, трансдукции.

Конъюгация – перенос генетического материала из клетки донора в клетку реципиент с помощью конъюгационного мостика. Клетки – доноры генетической информации несут F- плазмиду и F+ фенотип. Клетки – реципиенты не имеют F-плазмиды - F¯ - фенотип.

Стадии конъюгации:

1.происходит контакт между донором и реципиентом с помощью F – пилей.

2.образование конъюгационного мостика

3.передача генетического материала через конъюгационный мостик.

Синтез F – пилей, образование конъюгационного мостика, перенос генетического материала находятся под контролем генов F-плазмиды. В процессе конъюгации может передаваться из клетки в клетку плазмидная или хромосомная ДНК, т.е. различают плазмидную и хромосомную конъюгацию.

Плазмидная – F+ донор передаёт F-плазмиду реципиенту. Реципиент становится F+. Плазмидная конъюгация осуществляется по принципу котящегося кольца. Иногда F-плазмида может объединиться с другими плазмидами в коинтеграты и в таком составе переносится в клетку реципиента, т.о., например, может передаваться множественная лекарственная резистентность.

Хромосомная конъюгация .В случае встраивания F-плазмиды в хромосому донора клетка становится Hfr, а штамм называется Hfrштаммом. При хромосомной конъюгации реципиент получает часть Hfr и некоторую часть хромосомной ДНК донора, по фенотипу он обозначается как F’ (прим). Перенос всего Hfr явление очень редкое, для этого необходимо, что бы перенеслась вся хромосома донора. Этого не происходит из за разрывов конъюгационного мостика.

Аксдукция (разновидность конъюгации) F-плазмида встраивается в бактериальную хромосому, затем исключается из неё и захватывает хромосомные гены, далее автономно от хромосомы переходит в клетки реципиенты.

Трансформация – поглощение реципиентом чистого препарата ДНК из окружающей среды.

Наблюдается главным образом у Pneumococcus, Haemophilus, Bacillus, Neisseria.Трансформирующие агенты по своему размеру равны 1/200 генома бактерии.

Стадии трансформации: 1.Адсорбция ДНК донора на поверхности реципиента 2.Проникновение ДНК в клетку 3.Встраивание ДНК донора в хромосому реципиента

Клетки реципиента, способные поглощать чужеродную ДНК – называются компетентными Эффективность трансформации зависит от гомологии ДНК, т.о. внутривидовая трансформация более эффективна, по сравнению с межвидовой. Трансформация используется для картирования. Чем ближе два гена на хромосоме донора, тем с большей частотой они совместно переносятся в клетку реципиента.

Трансдукция – передача генетического материала от донора реципиенту с помощью фага. Описана главным образом у грамотрицательных бактерий: Escherichia, Shigella, Sasmonella, Pseudomonas. Открыли Ледерберг и Циндер в 1951. В трансдукции участвуют умеренные фаги.

Этапы трансдукции: 1.формирование трансдукционного фага происходит в клетке донора 2.адсорбция трансдукционного фага на поверхности реципиента 3.проникновение фага в клетку реципиента 4.встраивание фага в геном реципиента, т.е. реципиент приобретает новые свойства.

10. Трансформация: механизм, условия возникновения, значение в жизнедеятельности бактерий. I.Трансформация – непосредственная передача от клетки-донора к клетке-реципиенту фрагмента ДНК. Обычно при трансформации передается один ген, так как в клетку-реципиент может проникнуть очень малая часть хромосомы (около 1/100 длины хромосомы).

Условия для реализации механизма трансформации: 1. Свободная ДНК 2-х цепочечная, с молекулярной массой не менее 0,5-1х106 (при гибели бактерий и их разрушении ДНК попадает в окружающую среду и может быть воспринята другими клетками) 2. Гомологичность ДНК (гомологичная ДНК более устойчива к действию клеточных эндонуклеаз – то есть у неё «больше шансов» включиться в геном) 3. Компетентность клетки-реципиента: наличие белков, имеющих сродство к ДНК и выраженная проницаемость оболочки клетки; проницаемость оболочки является непродолжительной.

Стадии трансформации: 1. Адсорбция 2-х цепочечной ДНК 2. Проникновение (сопровождается разрушением одной цепи) 3. Интеграция.

11. Трансдукция: механизм, виды (специфическая, неспецифическая, абортивная), характеристика трандуцирующего фага, значение в жизнедеятельности бактерий.

II.Трансдукция – передача генов посредством фагов.

Виды трансдукции:

1.Неспецифическая (общая) – при сборке дочерних фаговых частиц в головку фага может попасть часть плазмидной или хромосомной ДНК бактериальной клетки-хозяина (в этом случае часть генома фага утрачивается – фаг становиться дефектным); таких фагов до 0,3% от всей дочерней популяции; передаются в этом случае любые гены!

2.Специфическая – происходит при репликации профага в лизогенной бактерии. При этом

«выщепление» профага сопровождается утратой части его генома и включением фрагмента хромосомной ДНК бактериальной клетки-хозяина (то есть трансдуцирующий фаг становиться дефектным). При проникновении в клетку-реципиент фаги встраиваются в бактериальную хромосому в участке, где имеется достаточно гомологии для интеграции. Таким образом, фаги при «выщеплении» и встраивании оказываются в одних и тех же участках бактериальной хромосомы – то есть «захватывают» и переносят одни и те же гены.

3. Абортивная – внесенный фрагмент ДНК донора не интегрирует с хромосомой реципиента, а остается в цитоплазме и там самостоятельно функционирует. Затем он передается только одной из дочерних клеток и впоследствии теряется в потомстве.

В трансдукции участвуют умеренные фаги.

Этапы трансдукции: 1.формирование трансдукционного фага происходит в клетке донора 2.адсорбция трансдукционного фага на поверхности реципиента 3.проникновение фага в клетку реципиента 4.встраивание фага в геном реципиента, т.е. реципиент приобретает новые свойства.

12. Конъюгация: механизм; зависимость от положения F-плазмиды, Hfr-штаммы, значение в жизнедеятельности бактерий.

III.Конъюгация – перенос генетического материала от клетки-донора к клетке-реципиенту при их контакте посредством конюгационного мостика.

Реализация механизма конъюгации:

1. Клетка-донор должна иметь F-плазмиду (F + ), отвечающую за синтез половых ворсинок, обеспечивающих формирование конюгационного мостика;

2. При автономном расположении F-плазмиды передается одна из цепей F-плазмиды и достраивается в клетке-реципиенте. Рекомбинант получает F-плазмиду и становиться донором, так как способен синтезировать половые ворсинки; Перенос F-плазмиды происходит с частотой близкой к 100%;

3. При интегрированном расположении F-плазмиды (Hfr) разрыв одной цепи ДНК происходит в зоне расположения плазмиды, в определенной точке – точке «О» (от англ. профаг бактериальная хромосома «выщепление профага»; индукция литического цикла Фаговая ДНК включает некоторые бактериальные гены Репликация фага Лизис клетки; выход фагов фаг поражает новую клетку включение профага в хромосому клетка приобретает донорскую ДНК в составе профага origin - начало). F-плазмида при этом остается в конце разорванной нити. В данной ситуации в клетку-реципиент поступает хромосомная ДНК, а F-плазмида не передается!

Длина участка цепи ДНК, поступившего в клетку-реципиент, зависит от времени существования мостика; за 2 часа возможен переход целой нити, но F-плазмида передается очень редко.

13. Плазмиды: виды, свойства, значение в жизнедеятельности бактерий.

Плазмиды. а) фрагменты ДНК с молекулярной массой 106 – 108 Д б) содержат 40 – 50 генов

Виды плазмид.

R-плазмиды: отвечают за синтез ферментов, инактивирующих антибиотики, что обеспечивает устойчивость бактерий к антибиотикам (бета-лактамазы и пр.);

Плазмиды патогенности: Tox – отвечают за синтез экзотоксинов Hly – отвечают за синтез гемотоксинов (вызывают гемолиз); Ent – отвечают за синтез энтеротоксинов и пр.

Плазмиды бактериоциногении. Отвечают за синтез веществ бактериоцинов. Бактериоцины – вещества, способные вызвать гибель бактерий того же вида или близких видов. Они являются факторами микробного антагонизма. Механизм губительного действия: нарушение функций цитоплазматической мембраны или нарушения процессов синтеза белка. Известно около 200

разновидностей бактериоцинов. Их продуцируют практически все микроорганизмы. Называются бактериоцины в соответствии с микроорганизмами, которые их продуцируют: стафилоцины (у стафилококков), протеоцины (у протеев), пиоцины (у синегнойной палочки), пестицины (у возбудителя чумы Yersinia pestis), колицины (у кишечной палочки).

Явление бактериоциногении используется в эпидемиологических исследования для внутривидовой дифференцировки бактерий, позволяющей определить источник инфекции. Используемая методика получила название - бактериоцинотипирование (колицинотипирование, пиоцинотипирование и пр.). Бактерии типируют по типам продуцируемых бактериоцинов, или по чувствительности к определенным типам бактриоцинов. Кроме того, явление бактерициногении используется создании штаммов с выраженными антагонистическими свойствами, используемых для лечении и профилактики инфекций, дизбиозов (колибактерин, лактобактерин и пр.)

Плазмиды биодеградации. Плазмиды, обеспечивающие деградацию неприродных соединений: камфоры, толуола и пр.

F-плазмиды (F-фактор) Плазмиды, отвечающие за синтез половых ворсинок (пилей). Эти плазмиды получили название «половой фактор». Половые ворсинки обеспечивают контакт между клетками в виде мостика (конъюгационный мостик), по которому в клетку-реципиент может переходить часть генома донорской клетки. Этот процесс получил название «конъюгация». F- плазмида располагается автономно и является конъюгативной; в связи с чем легко передается при конъюгации. Клетку, имеющую F-плазмиду обозначают F + - она синтезирует половые ворсинки и является донорской клеткой, клетку, у которой отсутствует F-плазмида обозначают F - - она является реципиентом. При конъюгации в случае автономности F-плазмиды передается сама плазмида и реципиент становиться F + - то есть приобретает способность синтезировать половые ворсинки (F-пили). F-плазмида может объединяться с хромосомой. Такие штаммы получили название Hfrштаммы (от англ. high frequency of recombination – высокая частота рекомбинаций) В этом случае при конъюгации передается не сама F-плазмида, а фрагмент хромосомы В этом случае при конъюгации передается не сама F-плазмида, а фрагмент хромосомы. То есть в клеткуреципиент могут перейти различные гены, отвечающие за различные признаки. При этом клеткареципиент не получает F-плазмиды и, соответственно, способности синтезировать F- пили.

14. Бактериоциногения: характеристика явления, значение в жизнедеятельности бактерий; использование бактериоциногенности и чувствительности к бактериоцинам в эпидемиологических исследованиях для установления идентичности культур. Бактериоциногения(бактериоцины + греч. genea порождение, образование; син.бактериоциногенность)-способность некоторых штаммов бактерий продуцировать бактериоцины; Б. может служить факторомустойчивости нормальной микрофлоры к патогенным микробам; у патогенных бактерий Б. можетоказываться дополнительным фактором их патогенности.

Отвечают за синтез веществ бактериоцинов. Бактериоцины – вещества, способные вызвать гибель бактерий того же вида или близких видов. Они являются факторами микробного антагонизма. Механизм губительного действия: нарушение функций цитоплазматической мембраны или нарушения процессов синтеза белка. Известно около 200 разновидностей бактериоцинов. Их продуцируют практически все микроорганизмы. Называются бактериоцины в соответствии с микроорганизмами, которые их продуцируют: стафилоцины (у стафилококков), протеоцины (у протеев), пиоцины (у синегнойной палочки), пестицины (у возбудителя чумы Yersinia pestis), колицины (у кишечной палочки).

Явление бактериоциногении используется в эпидемиологических исследования для внутривидовой дифференцировки бактерий, позволяющей определить источник инфекции. Используемая методика получила название - бактериоцинотипирование (колицинотипирование, пиоцинотипирование и пр.). Бактерии типируют по типам продуцируемых бактериоцинов, или по чувствительности к определенным типам бактриоцинов. Кроме того, явление бактерициногении используется создании штаммов с выраженными антагонистическими свойствами, используемых для лечении и профилактики инфекций, дизбиозов (колибактерин, лактобактерин и пр.)

15. Основные задачи медицинской биотехнологии и генной инженерии; методы генной инженерии.

Биотехнология и генная инженерия Биотехнология – область знаний, направленная на создание продуктов, необходимых для

человека, с помощью биологических объектов. Термин «Биотехнология» вошёл в обиход в 70-х годах ХХ века, хотя методы биотехнологии используются испокон веков в хлебопечении, виноделии, пивоварении, сыроделии, земледелии (получение перегноя). Все эти отрасли связанны с культивированием микроорганизмов. В настоящее время к биотехнологическим производствам относят также получение вакцин, антибиотиков и др. БАВ, очистка сточных вод с помощью биологических фильтров.

Генная инженерия – одно из направлений биотехнологии. Генная инженерия разрабатывает методы создания рекомбинантных молекул ДНК с заданными свойствами и способы переноса этой ДНК в клетки продуценты.

Методы:

специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;

быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;

конструирование рекомбинантной ДНК;

гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью, основанную на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот;

клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;

введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы