Микробные системы конструируют таким образом, чтобы они обладали наибольшим разнообразием путей метаболизма участвующих в деструкции ксенобиотиков, синтезировали вещества, например биосурфактанты, способствующие биодоступности загрязнений, могли бы активно функционировать в различных физико-химических условиях окружающей среды, были безопасны для человека, легко элиминировались из природной среды после удаления контаминантов.

Для контроля за численностью рекомбинантных организмов в их геном внедряют биологические маркеры, позволяющие легко выявлять присутствие таких организмов на фоне других микробных популяций. В естественных условиях в отсутствие субстрата-ксенобиотика генетически модифицированные микроорганизмы через несколько поколений утрачивают несвойственные им гены деструкции, что, с одной стороны, затрудняет их целевое использование, а с другой – значительно облегчает задачу обеспечения биобезопасности.

Использование генетически модифицированных микроорганизмов в настоящее время в большинстве стран разрешено лишь для проведения полевых экспериментов. Вместе с тем некоторые биотехнологические фирмы разрабатывают технологии применения рекомбинантных микроорганизмов для деградации опасных веществ в биореакторах.

4.5.3.Биопрепараты для рекультивации территорий и восстановления плодородия почв

Рекультивация – комплекс мероприятий, направленных на восстановление плодородия и практической ценности нарушенных земель, почвенного покрова, естественного экологического равновесия ранее загрязненных или выведенных из хозяйственого использования территорий. Методы рекультивации развивались по мере накопления практического опыта поддержания плодородия почв, совершенствования агротехники возделывания сельскохозяйственных культур, углубления знаний закономерностей основных процессов, протекающих в почве.

Почвы могут не содержать опасных концентраций загрязнений, но их механическая структура может быть нарушена, изменены физико-химические свойства, снижены содержание биогенных элементов и активность биоты, ухудшено фитосанитарное состояние почв и посевов растений, т. е. в целом нарушено плодородие почвы. Биопрепараты, предназначенные для рекультивации, активизируют почвенные процессы, направленные на восстановление ее плодородия.

К биопрепаратам для рекультивации и восстановления плодородия почв можно отнести:

почвенные грунты, различные органические отходы и другие материалы, модифицированные при химическом или микробиологическом воздействии, в процессе анаэробного сбраживания, аэробной ферментации, компостирования или вермикомпостирования;

специализированные препараты на основе микроорганизмов и ферментов: биоудобрения, включающие азотфиксаторы, микроорганизмы, улучшающие доступ фосфора растениям, препараты эндомикоризных грибов и др.;

биопрепараты против возбудителей различных заболеваний растений (средства защиты растений), для улучшения фитосанитарного состояния почв. Спектр таких биопрепаратов достаточно обширен. Их получение и применение относятся к сфере деятельности сельскохозяйственной биотехнологии.

Различные органические отходы и материалы, внесенные в почву, способствуют восстановлению почвенной структуры, увеличению содержания гумусовых веществ в почве, повышают устойчивость ее к эрозии, служат источником биогенных элементов, различных биологически активных веществ, способствующих развитию растений, формированию микробного биоценоза, повышению урожайности возделываемых культур, устойчивости их к возбудителям заболеваний. Принципы получения различных органических удобрений, стимулирующих добавок, материалов из органических отходов рассмотрены ранее в разделах 3.2, 3.3. Среди других зарекомендовавших себя препаратов этой группы – препараты на основе гуминовых кислот.

Малые дозы (0,1–1 кг/м2) препаратов гуминовых кислот и гуматов, особенно низкомолекулярные фракции (фульвокислоты), а также различные модификации гуминовых веществ (гидрогуматы, нитрогуматы, оксигуматы), оказывают стимулирующее действие на развитие растений. Причина такого влияния не совсем ясна, учитывая тот факт, что практически любые пахотные почвы содержат аналогичные гуминовые кислоты или гуматы в значительно больших количествах, но они оказываются менее доступными для растений и сходного стимулирующего действия не проявляют.

Гуминовые препараты получают путем экстракции гуминовых веществ из различного сырья: угля, торфа, сланцев, сапропеля и др. Чаще всего используется мягкая щелочная экстракция растворами NaOH, KOH, Ca(OH)2, NH4OH, а также Na4P2O7. Гуминовые вещества экстрагируются также диметилсульфоксидом, диметилформамидом, ацетоном. При использовании щелочных растворов извлекается больше высокомолекулярных фракций гуминовых веществ.

На рис. 4.35 представлена схема одного из вариантов получения чистых гуматов из угля.

Исходное сырье измельчают, подсушивают и обрабатывают водным раствором NaOH для извлечения гуминовых кислот. Обработку проводят, как правило, при повышенных температурах в интервале 80–160 °С и избыточном давлении. В этих условиях гуминовые вещества не только экстрагируются, но и частично гидролизуются. Полученный раствор, содержащий гумат Na, отделяют от твердой фазы и упаривают. Гуматы осаждаются и отделяются от маточного раствора, который повторно используется, возвращается на стадию щелочной экстракции.

Рис. 4.35. Схема получения чистого гумата натрия из угля

По другому варианту такой технологии получают продукт без отделения твердой фазы (балластные препараты). Потребитель сам выделяет гуминовые препараты путем их настаивания на воде.

Возможно получение и препаратов гуминовых веществ, очищенных от растворимых низкомолекулярных фракций, например, путем диализа, совмещенного с ионным обменом. Однако такая очистка приводит к потере фульвокислот (теряется до 40% органического углерода и 70% органического азота).

В модифицированных вариантах гуминовые препараты получают путем обработки исходного сырья сильными кислотами (HCl, H2SO4), окислителями (Cl2, O3, HNO3 конц., оксиды азота), ультразвуком, радиолизом, бароформингом и др.

Предварительная обработка гуминового сырья 5 н. раствором HNO3 повышает выход гуминовых кислот в 5–6 раз, обработка ультразвуком – более чем

в10 раз. Обработка HCl (6 н., 110 °С), H2SO4 (72% раствор, 16 ч при 100 °С) высвобождает аминокислоты, сахара.

При получении гидрогуматов используется двухстадийная обработка торфа: кислотный гидролиз на первой стадии и щелочная обработка прогидролизованной торфяной пульпы раствором NaOH на второй стадии. При такой обработке получают гуминовые препараты с высоким выходом от исходного сырья и повышенной биологической активностью.

Нитрогуматы получают путем окисления гуминового сырья азотной кислотой.

Воснове технологии получения оксигуматов лежит окисление торфа в щелочной среде в присутствии катализатора – солей двухвалентного металла. При такой обработке выход фульвокислот повышается.

Возможна предобработка сырья и биологическими методами. Так, внесение

всырье соединений, стимулирующих активность микробиологических процессов, снижает выход гуминовых кислот, но повышает выход фульвокислот.

Гуминовые препараты могут использоваться не только как стимуляторы роста растений, но и как мелиоранты-структураторы. Обработка ими песчаной почвы (в количестве 3%) позволяет более чем на порядок увеличивать ее способность удерживать влагу.

Для мелиоративной цели больше подходят препараты гуминовых кислот, а не гуматы щелочных металлов. Гуминовые кислоты образуют в растворе гидрогели, которые более устойчивы, долгое время не оседают, лучше впитываются в почву, чем гуматы. При получении препаратов-мелиорантов используют влажное гумусосодержащее сырье (торф, сапропель), не подвергавшееся высушиванию. Частицы высушенного торфа, сапропеля претерпевают необратимые структурные изменения, и мелиоранты, полученные на их основе, оказываются малоэффективными структурообразователями.

Вносить гуминовые препараты нужно с учетом их pH и буферных свойств почвы. Так, легкие (песчаные) почвы имеют низкую буферность и для них неприемлемы сильнощелочные гуматы (максимальный pH 10,5), внесение которых в количестве 2–4% может сдвинуть pH почвы в щелочную область.

В комплексе работ по рекультивации и восстановлению ранее загрязненных почв, а также различных отвалов, терриконов горнодобывающей промышленности хорошо зарекомендовало себя использование биопрепаратов и биоудобрений на основе живых микроорганизмов, разработанных и вносимых в почву для повышения урожайности сельскохозяйственных культур. Биоудобрения наиболее эффективны на бедных, низкоплодородных почвах, поэтому они стали использоваться и для целей рекультивации. Особенно важны бактерии, обитающие в ризосферной (прикорневой) зоне растений и обладающие совокупностью полезных для растений свойств. Такие бактерии принято обозначать как PGPR (рlant growth-рromoting rhizobacteria – ризобактерии, способствующие росту растений).

Среди классических биоудобрений, предназначенных для сельского хозяйства, но которые могут использоваться в постремедиационных работах, можно выделить биопрепараты с азотфиксаторами, бактериальные препараты, улучшающие доступ фосфора растениям, препараты эндомикоризных грибов.

Традиционные биопрепараты с азотфиксаторами выпускаются на основе свободноживущих бактерий рр. Azotobacter, Azospirillum и симбиотических азотфиксаторов – клубеньковых бактерий рр. Rhizobium и Bradirhizobium. Усвоение ими азота и обогащение почвы биологически фиксированным азотом наиболее эффективно, если она обеднена минеральным азотом, но обогащена источниками углерода и энергии, необходимыми для жизнедеятельности азотфиксаторов: корневыми выделениями, корневыми и пожнивными остатками растений и т. п. В почве должны обеспечиваться подходящие физико-химические условия: оптимальный pH (для ризобий pH 3,5–8,7), отсутствие засоления (содержание солей, особенно NaHCO3 не более 0,4%), наличие в достаточном количестве фосфора, оптимальные влажность, температура, газообмен. Для клубеньковых бактерий характерна высокая видовая специфичность: определенный вид бактерий обычно образует клубеньки только на одном или немногих видах растений (бобовых), поэтому для целей рекультивации препараты с симбиотическими азотфиксаторами могут использоваться лишь в случаях, если технологией рекультивационных работ предусматривается высев бобовых.

Нитрагин – биологическое удобрение на основе клубеньковых бактерий р. Rhizobium. В России было разработано производство почвенного и сухого нитрагина.

Почвенный нитрагин – культура клубеньковых бактерий, выращенная в стерильной почве. 1 г такого препарата содержит не менее 0,3 млрд жизнеспособных клеток.

Сухой нитрагин (ризобин) – порошок с титром >9 млрд жизнеспособных бактерий на 1 г препарата в смеси с наполнителем (бентонитом, каолином, мелом). Технология его получения предусматривает глубинное культивирование ризобий с последующим выделением клеток, смешением с защитной средой и сушкой (рис. 4.37). Узкое место технологии – стадия сушки, поскольку ризобии весьма чувствительны к нагреву и дефициту влаги.

Препараты нитрагина применяют совместно с фосфорно-калиевыми и органическими удобрениями, которые повышают активность клубеньковых бактерий.

Ризоторфин – более эффективный по сравнению с нитрагином препарат, технология получения которого была разработана в 1973–1977 гг. (рис. 4.38). Содержит клубеньковые бактерии р. Rhizobium на торфе.

Торф является наиболее подходящим субстратом-носителем по влагоемкости, удельной поверхности, содержанию органического вещества, доступности

истоимости. Однако это нестандартный носитель, который часто содержит токсичные для клубеньковых бактерий вещества. В технологии производства ризоторфина используется низкосолевой кислый или слабокислый торф (pH 3,0–6,0). Торф подсушивается до влажности 25–30% и размалывается до среднего размера частиц <0,1 мм. Этим достигается хорошая прилипаемость препарата к инокулированным семенам. Для повышения прилипаемости в торф могут добавлять водорастворимый клей, например карбоксиметилцеллюлозу. Добавки мела обеспечивают нейтральный pH.

Втехнологии используется радиационная стерилизация торфа, поскольку тепловая стерилизация неэффективна из-за низкой теплопроводности торфа

ивозможности накопления токсичных веществ при тепловой обработке. Выращивание ризобактерий проводят на отваре гороха, фасоли, люпина

с добавками сахарозы, глюкозы или маннита и минеральных солей. Полученной суспензией с помощью инъекционной иглы под давлением инокулируют пакеты с подготовленным торфом в стерильных условиях до конечной влажности 45–55%. Перед инокуляцией в жидкую культуру вносят стерильные растворы углеводов (мелассы, декстрина, молочной сыворотки) в количестве до 3% к массе сухого торфа.

Рис. 4.37. Блок-схема технологии получения сухого нитрагина

Инокулированные пакеты загружаются во вращающийся барабан на 3–5 мин для перемешивания содержимого пакета. При необходимости быстрого получения готового препарата инокулированные пакеты после перемешивания их содержимого помещают на 4–6 сут в термостат при температуре 20–21 °С или на 3 сут при 28 °С. В последующем рост ризобактерий продолжается еще около 5 недель при 20 °С. За это время численность жизнеспособных клеток увеличивается в 2–5 раз. Медленно растущие культуры бактерий хранят при температуре 12–15 °С, быстрорастущие культуры – при 5–10 °С. Через 2 года хранения препарата при 5 °С жизнеспособность клеток составляет 10% от первоначальной. При хранении при 25 °С уменьшение жизнеспособности клеток до 10% от первоначальной происходит через 8 недель.

Препараты «Нитрагин» и «Ризоторфин» используют совместно с высевом зернобобовых культур.

Для улучшения доступа фосфора к растениям в качестве биоудобрений используют препараты на основе бактерий и на основе грибов.

Бактериальный препарат фосфобактерин содержит бактерии Bacillus megaterium var. phosphaticum, обладающие способностью превращать сложные фосфорсодержащие органические соединения (нуклеиновые кислоты и др.) и трудноусвояемые минеральные фосфаты (трехосновные фосфаты железа, алюминия и кальция, пирофосфаты, полифосфаты) в доступную для растений форму. Кроме того, бактерии вырабатывают биологически активные вещества (тиамин, биотин и другие витамины), стимулирующие рост растений. Препарат не заменяет фосфорные удобрения и не действует без них.

Технология получения фосфобактерина включает стадии выращивания микробных клеток и спор, их выделения из ферментационной среды, сушки (рис. 4.39).

Рис. 4.38. Блок-схема технологии получения ризоторфина

Из препаратов эндомикоризных грибов наиболее эффективны грибы – симбионты растений, образующие везикулярно-арбускулярную микоризу.

Одни грибы в результате размножения образуют вокруг мелких корешков чехол – эктомикоризу. Другие, проникая в кортикальную ткань корней, образуют эндомикоризу. В результате проникновения устанавливаются симбиотические отношения, выгодные растениям-хозяевам. Две из трех известных разновидностей эндомикоризы встречаются только в пределах семейств Ericaceae и Orchidaceae. Третья из них, известная под названием «везикулярноарбускулярная микориза» (ВА-микориза), особенно важна для сельского хозяйства. ВА-микориза найдена у большинства важнейших видов сельскохозяйственных растений. Микориза ВА, образуемая грибом-фикомицетом из семейства Endogonaceae, встречается особенно часто в большинстве почв всех климатических зон.

Рис. 4.39. Блок-схема технологии получения фосфобактерина

ВА-микориза помогает растениям поглощать из почвы фосфаты. Фосфатионы в почве малоподвижны и поэтому вокруг корней их часто недостает. Гифы микоризы, вырастающие из корневого мицелия и распространяющиеся за пределы области дефицита фосфата, переносят его непосредственно в клетки рас- тения-хозяина. При этом также увеличивается поступление микроэлементов. ВА-микориза повышает концентрацию гормонов роста в растениях, усиливает образование клубеньков и азотфиксацию. Особенно часто необходимость внесения в почву грибного мицелия и спор, вызывающих образование ВА-микори- зы, возникает на стерилизованных почвах.

Как биологический препарат используют инокулят ВА-микоризы – растения с ВА-микоризой или же инфицированную почву. При этом у растениядонора и растения-хозяина, для которого предназначен вырабатываемый инокулят, не должно быть общих заболеваний корневой системы. Использование мицелия гриба без растения-хозяина позволило бы избежать опасности заболевания, однако проблема получения мицелия гриба без растения-хозяина еще не решена.

Биопрепараты на основе эндомикоризных грибов эффективны при биологической рекультивации земель с целью не только увеличения доступности фосфора и микроэлементов растениям, но и повышения стрессоустойчивости растений, при восстановлении сульфидсодержащих грунтов. Для этих целей возможно и совместное использование фосфатмобилизующих бактерий и эндомикоризных грибов.

Современные биопрепараты, предназначенные для рекультивации территорий и восстановления плодородия почв, возврата их в хозяйственное пользование, создаются на основе методов биотехнологии, скрининга и селекции высокоактивных штаммов почвенных микроорганизмов. Такие биопрепараты могут включать сообщество полезной почвенной микрофлоры, характерное для местных условий, микроорганизмы-аддитивы, повышающие активность основной микробной составляющей препарата, обладающие фунгицидной и инсектицид-

ной, гидролитической (целлюлолитической, лигнолитической, протеолитической) активностями, гуминовые вещества, сорбенты и другие добавки, повышающие жизнеспособность микроорганизмов, их активность, стимулирующие и регулирующие развитие растений, расширяющие спектр действия препаратов. Они экологически безопасны, имеют относительно невысокую стоимость, позволяют снижать расходы органических удобрений и мелиорантов. Технология их получения типична для биотехнологического производства и хорошо отработана.

Ряд биопрепаратов для рекультивации содержит микроорганизмы-азотфик- саторы рр. Azotobacter, Azospirillum. Некоторые штаммы этих бактерий способны к кометаболизму и биодеструкции таких загрязнений, как углеводороды нефти, используя для этого корневые выделения растений. Они синтезируют полисахариды и другие вещества, что важно для структурирования почвы и задержания влаги, обогащения почвы гуминовыми кислотами. Синтез повышенных количеств витаминов, гормонов, аминокислот стимулирует развитие растений. Пример такой разработки – препарат «Риазофилл». Он разработан совместно Институтом микробиологии РАН и Институтом физиологии растений РАН и включает азотфиксирующие клубеньковые бактерии (ризобии) и азоспириллы. По эффективности действия Риазофилл превосходит однокомпонентный препарат Нитрагин.

Среди PGPR различных таксономических групп широким набором полезных для растений свойств обладают бактерии р. Pseudomonas: ряд штаммов

Pseudomonas putida, P. fluorescens, P. aureofaciens и другие. Некоторые из них стимулируют рост растений в результате синтеза бактериями различных метаболитов, полезных для растений, регуляторов роста (индолилуксусной кислоты, гиббереллиноподобных веществ), другие вытесняют и подавляют развитие почвенных фитопатогенов или микроорганизмов, угнетающих рост растений, индуцируют у растений устойчивость к фитопатогенам, третьи способны улучшать фосфорное питание растений, фиксировать атмосферный азот. Псевдомонады холодоустойчивы, для штаммов-азотфиксаторов оптимальная температура для азотфиксации 14–20 °С. В то же время для процесса азотфиксации других ассоциативных диазотрофов, например, бактерий р. Azospirillum, оптимальной температурой является 25 °С. На основе различных штаммов псевдомонад в настоящее время разрабатываются биологические средства защиты растений от фитопатогенов, биопрепараты, стимулирующие продуктивность растений.

Разработанный в НИИ экологии топливно-энергетического комплекса (г. Пермь) препарат «БИОР-АБ» получают на основе бурого угля. Он содержит азотфиксирующие и фосфатрастворяющие бактерии, ряд витаминов, органических кислот и биогенных элементов и рекомендуется для рекультивации шахтных отвалов, утилизации твердых отходов угольной промышленности. При применении данных препаратов растительный покров и дерновый слой восстанавливаются в течение 2–3 лет.

В НПО «Биотехнология» разработан ряд препаратов: «Азотовит», «Бактофосфин» и другие, стимулирующих рост растений, развитие почвенной микрофлоры, прорастание семян, фотосинтез, разложение стерни. Препарат «Азо-