3.2.1.1.Технологические особенности микробиологической конверсии в кормовой белок

те, содержанию примесей, строится и вся технологическая схема производства. Типовая схема, основные стадии и реализующие их технологические процессы представлены на рис. 3.4.

Рис. 3.4. Типовая схема, основные стадии и реализующие их технологические процессы в биотехнологических производствах

При получении кормовых продуктов не используются дорогостоящие питательные среды, методы выделения, очистки и концентрирования продукта. Технология получения кормового продукта с использованием микроорганизмов включает (рис. 3.5) стадии подготовки сырья, воздуха, посевного материала, другие вспомогательные операции, стадию ферментации, выделения и концен-

Ключевая стадия технологического процесса – ферментация в биореакторе (ферментере). На рис. 3.6 представлена схема типичного биореактора для культивирования микроорганизмов глубинным способом с подачей основных технологических потоков в аппарат и контролем параметров ферментации. Системы стерилизации, перемешивания, пенорегулирования, автоматизации

ибиореактор в целом должны соответствовать морфофизиологическим свойствам продуцентов, их чувствительности к посторонней микрофлоре, потребностям в кислороде, чувствительности питательной среды к тепловой стерилизации.

Процесс выделения продукта должен обеспечивать сохранность его качества

ибиологических свойств: предотвратить потери белка, незаменимых аминокислот, витаминов в связи с нагревом, механическим и химическим воздействием, наличием микрофлоры загрязнений.

Выбор биологических продуцентов

Микроорганизм, используемый как продуцент белка, должен отвечать ряду требований, среди которых наиболее важные следующие:

Высокий коэффициент выхода продукта или продуктов из сырья (высокий коэффициент конверсии).

Высокая удельная скорость роста.

Высокий конечный уровень накопления целевого продукта в среде культивирования.

Высокое сродство продуцента к углеродным энергетическим субстратам.

Стабильность и неприхотливость.

Способность доминировать в биоценозе ферментера при нестерильных условиях культивирования.

Устойчивость штамма к собственным продуктам метаболизма. Это особенно важно для процессов с рециркуляцией культуральной жидкости.

Устойчивости штамма к условиям культивирования, изменяющимся в широких пределах.

Способность штамма обеспечивать необходимые качества готового продукта: высокое содержание белка, незаменимых аминокислот; наличие определенного количества витаминов в микробной клетке, небольшое количество нецелевых метаболитов в среде культивирования.

Технологические требования: хорошая фильтруемость, сепарируемость, флотируемость, подходящая температура культивирования.

Безвредность для животных.

Непатогенность для человека. У некоторых людей возможна аллергия к определенным видам микроорганизмов, но этот признак не означает их патогенность.

Если есть возможность выбора между бактериями, дрожжами или грибами, то учитывают всю совокупность факторов. Бактерии быстрее растут, могут содержать больше белка (до 80%), но менее технологичны – хуже фильтруются, сепарируются по сравнению с дрожжами. Мицелиальные плесневые грибы, в отличие от дрожжей и бактерий, содержат значительно меньше нуклеиновых

кислот, высокое содержание которых снижает качество кормового продукта1, а также способны утилизировать более широкий ряд углеводов, могут лучше расти на твердых субстратах (сено, солома и другое растительное сырье), что позволяет использовать для их выращивания дешевые отходы сельского хозяйства и пищевой промышленности. Волоконная структура мицелия дает возможность применять дешевые методы фильтрации. Однако грибы медленно растут – 3–7 сут, образуют мицелий, который склонен к лизису и сильно загрязняет среду продуктами лизиса и токсинами.

При промышленной переработке растительных, углевод- и целлюлозосодержащих отходов чаще всего используют дрожжи (жидкие субстраты) и плесневые грибы (твердые растительные субстраты).

Выбор метода культивирования для стадии основной ферментации

Если цель ферментации – получение кормового продукта, максимально обогащенного белком микроорганизмов, конверсию проводят в аэробных условиях. Выход биомассы организмов в этих условиях в несколько раз выше, чем в анаэробных.

Используются периодические и непрерывные ферментационные процессы. Непрерывные процессы более производительны, более стабильны во времени,

для них меньше расходы на эксплуатацию оборудования, их легче регулировать

иавтоматизировать. В производстве биомассы для кормовых целей они используются в крупномасштабных технологиях переработки гидролизатов древесины, торфа, сульфитных щелоков, спиртов, углеводородов, органических кислот, когда ферментацию можно проводить в неасептических условиях. Если процесс основной ферментации ведут непрерывным способом, то его обычно организуют в виде одноступенчатого реактора или каскада реакторов. Каскад реакторов может представлять собой один аппарат, разделенный на секции. Многоступенчатый процесс целесообразен для переработки трудноокисляемых субстратов, смеси последовательно потребляемых субстратов (например, гексоз и пентоз) и в случае высокого остаточного содержания субстратов при одноступенчатой ферментации.

Впериодическом процессе используется один или несколько параллельно

инезависимо работающих аппаратов. Если аппаратов несколько, то организуется их работа в циклическом режиме. Б;ольшая часть из них находится в режиме ферментации, а меньшая – в режиме мойки и стерилизации.

Вкрупномасштабных процессах непрерывного культивирования на гидролизатах древесины, торфа, щелоках, барде ферментация проводится в неасептических или нестрого асептических условиях, поскольку в проточных режимах при крупнотоннажном производстве сложно обеспечивать стерильность в течение длительного времени. В маломасштабных процессах с использованием легкоинфицируемых посторонней микрофлорой субстратов – плодоовощных соков, молочной сыворотки и других – необходимо поддерживать условия стерильности: обеспечить герметизацию аппаратуры, ввод чистой культуры в аппа-

1 У многих животных, в частности у птиц, высокое содержание нуклеиновых кислот в кормах приводит к нежелательным изменениям в обмене веществ, повышенному образованию мочевой кислоты, что выражается в угнетении роста молодняка или понижении продуктивности взрослых животных.

рат, защиту от посторонней микрофлоры. В этом случае требования к квалификации обслуживающего персонала, оборудованию и уровню технологии выше, чем в неасептических процессах.

Технология получения микробиологического продукта сильно зависит от того, используется ли глубинное, глубинное гетерофазное или поверхностное культивирование.

Глубинное культивирование проводят внутри водной фазы. В среду вносят посевной материал, органический субстрат в растворенном состоянии, растворы солей (см. рис. 3.6). Глубинное культивирование используется в большинстве промышленных биотехнологических процессов. Методом глубинного культивирования перерабатываются сульфитный щелок, гидролизаты древесины, торфа, спиртовая барда, молочная сыворотка и другие субстраты, не содержащие твердой фазы.

Вэтих случаях в качестве продуцента белка чаще всего используются дрожжи.

Втабл. 3.18 приведены сравнительные технико-экономические показатели получения некоторых кормовых продуктов методом глубинной ферментации и их кормовой эффективности.

Таблица 3.18.

Технико-экономические показатели крупнотоннажных производств кормового микробного белка и его кормовой эффективности

1 Условное топливо — принятая при технико-экономических расчетах единица, служащая для сопоставления тепловой ценности различных видов топлива. Теплота сгорания 1 кг твердого условного топлива (или 1 м3 газообразного) 29,3 МДж.

330 Глава 3

Окончание таблицы 3.18.

Типичные показатели глубинной ферментации и содержание наиболее важных компонентов в биомассе кормовых дрожжей при выращивании на углеводсодержащих средах:

– концентрация микроорганизмов 0,5–2% (по асб) после ферментации

–концентрация углеводов в ис- 1–5% ходной среде

–выход биомассы с единицы суб- 0,4–0,5 страта (углеводов)

4% от массы белка – при выращивании дрожжей на барде

Глубинное гетерофазное культивирование проводят в жидкой фазе с внесением и суспендированием в качестве субстратов дробленого зерна кукурузы, картофеля, различных плодоовощных отходов. Питание микроорганизмов при этом способе может осуществляться на поверхности, но сами микроорганизмы находятся в толще жидкости. В качестве микроорганизмов используют дрожжи р. Candida, плесневые грибы рр. Fusarium, Chrysosporium, Aspergillus, Myrothecium, совместные культуры бактерий р. Cellulomonas, обладающих целлюлолитической

активностью, и дрожжей рр. Saccharomyces, Candida, утилизирующих образующуюся целлобиозу. В результате ферментации получают продукт, содержащий остатки исходного сырья и микробную биомассу с суммарным содержанием протеина до 20%.

При таком методе трудно организовать непрерывный процесс, загружать, перемешивать и выгружать содержимое биореактора в присутствии твердой фазы, сложно обеспечить необходимые массообменные условия в биореакторе для снабжения микроорганизмов кислородом.

Поверхностное культивирование (твердофазная ферментация) проводится в массе слегка увлажненного растительного субстрата (влажность от 25 до 75%). В качестве субстрата могут использоваться различные отходы – солома, древесные опилки, виноградные выжимки, другие лигноцеллюлозные материалы, отруби, пивная дробина, измельченный картофель и т. п. Рост микроорганизмов происходит на границе фаз твердый субстрат – вода – воздух; в некоторых случаях – внутри частиц субстрата.

Различают три варианта твердофазной ферментации.

Поверхностная твердофазная ферментация – «тонкий слой». Рост микроорганизмов происходит в слое субстрата 3–7 см в кюветах, противнях, на стеллажах в камере, где поддерживаются необходимая температура и влажность воздуха.

Глубинная твердофазная ферментация в неперемешиваемом слое – «высокий слой». Рост происходит по всей массе аэрируемого субстрата.

Твердофазная ферментация в перемешиваемой и аэрируемой массе субстрата во вращающихся барабанах, со шнековыми мешалками и другими перемешивающими устройствами.

Для твердофазной ферментации используются мицелиальные грибы, макромицеты в мицелиальной форме, смешанные культуры грибов и дрожжей, чистые культуры дрожжей (Endomycopsis fibuligera, Saсcharomycopsis spp. на крахмалистых субстратах).

При переработке лигноцеллюлозных материалов методом твердофазной ферментации эффективны дереворазрушающие грибы – ксилотрофы, которые способны развиваться на средах относительно простого состава, активно синтезируют гидролитические и окислительные ферменты, участвующие в разложении целлюлозы и лигнина, и повышают перевариваемость субстратов. Грибы, обогащающие субстраты белком, базидиомицеты, они относятся к родам Pleurotus (вешенка), Coriolus (кориол), Panus (Lentinus, пилолистник),

Phanerochaete (белая гниль), Tyromyces (тиромицес), Schizophyllum (щелелистник) и являются хорошо известными деструкторами древесины. Для увеличения степени расщепления лигноцеллюлозных материалов и ускорения роста грибов часто вносят легкоусвояемые и дешевые источники углеродного питания, например свекловичный жом или картофельную мезгу, или предобрабатывают лигноцеллюлозные субстраты физическими, физико-химическими, химическими или энзиматическими методами.

332 Глава 3

Типичные характеристики субстрата и условия твердофазной ферментации

При обогащении белком соломы, пшеничных и кукурузных отрубей с использованием мицелиальных грибов Fusarium spp., Acremonium spp.,

Allescheria spp., Trichosporon capitatum, Aspergillus japonicus в результате твердофазной ферментации методом «тонкого слоя» получают продукт с содержанием белка до 16–22% (по сухой массе). При ферментации пшеничной соломы методом «высокого слоя» без перемешивания продукт содержит до 14% белка при использовании мицелиальных грибов и до 12% белка при ферментации с базидиальными макромицетами. При использовании в тех же условиях необработанных опилок получают продукт с содержанием белка 6–8%. Ферментация соломы, щепы приводит не только к увеличению содержания белка в кормовой массе, но и увеличивает доступность остатков целлюлозы и гемицеллюлозы для переваривания животными.

При выращивании базидиальных грибов на соломе с добавлением 10–30% (от массы сухого субстрата) свекловичного жома или картофельной мезги содержание белка в переработанном субстрате увеличивается с 2,8 до 9,0–12,0%.

При твердофазной ферментации крахмалсодержащих отходов (картофельных, банановых, маниоковых) содержание белка повышается с 2,5–6,5 до 17–20%.

Преимущества твердофазной ферментации: относительная простота среды; часто достигается большая концентрация сухих веществ, меньше энергетические и тепловые затраты на ферментацию (в 3–7 раз), на концентрирование продукта по сравнению с глубинным культивированием; незначительное количество воды, используемой в процессе, меньше объемы сточных вод; некоторые процессы протекают более интенсивно, чем в глубинной культуре; можно долго хранить и легко транспортировать высушенный кормовой продукт. Одна-

Скорость отмирания клеток с ростом температуры увеличивается быстрее, чем скорость денатурации питательных компонентов. В соответствии с уравнениями

где No, Nжив. – число живых клеток исходное и текущее; Co пит. вещ-в, Спит. вещ-в – исходное и текущее содержание питательных веществ в среде; kкл., kпит. вещ-в – кинетические кон-

станты отмирания клеток и денатурации питательных веществ, – время стерилизации, A – предэкспоненциальный множитель; E – энергия инактивации клеток и денатурации питательных веществ, T – температура стерилизации, при 2 < 1 и T2 > T1 при одинаковом критерии стерилизации (N1жив./No = N2жив./No)

При одинаковом критерии стерилизации режимы с большей температурой и меньшей выдержкой обеспечивают лучшую сохранность питательной среды, чем при большей выдержке, но меньшей температуре. Поэтому важно быстро нагреть питательную среду до температуры стерилизации (при нагреве острым паром) и выдержать ее в течение требуемого времени. Трубчатый выдерживатель вытеснительного типа обеспечивает одинаковое время выдерживания всего объема среды при необходимой температуре.

При проведении ферментационного процесса применяются также меры для исключения попадания посторонней микрофлоры внутрь аппарата: используется минимальное количество штуцеров, труб, соединений; стерилизуются уплотнения мешалок и контрольно-измерительные приборы. Для предотвращения попадания инфекции с обратным током отходящего из ферментера газа на выходе устанавливаются ловушки и обратные клапаны; ферментацию ведут при небольшом избыточном давлении.

Стерилизация (пастеризация) нагревом при атмосферном давлении используется для процессов, не требующих строгих асептических условий (при подготовке к ферментации спиртовой барды, молочной сыворотки, твердых субстратов, концентрированных растворов минеральных солей, при тепловой обработке ферментированных продуктов).

Стерилизация фильтрацией. Используется для стерилизации подаваемого воздуха. Микрофильтрация – для стерилизации термолабильных компонентов питательных сред, титрующих агентов (даже в концентрированном растворе NH3 могут присутствовать жизнеспособные споры микроорганизмов). Сами фильтры предварительно стерилизуют тепловым или химическим способом.

Химическая стерилизация. Используется обработка оборудования антисептиками, формальдегидом, NaOH, H2O2 (дорогостоящий агент, вызывающий коррозию), этанолом. Химическими реагентами стерилизуют фильтры (формальдегидом), датчики (этанолом), оборудование для выделения и концентрирования продукта (раствором с активным хлором и NaOH).

Химические реагенты должны легко вымываться, не загрязнять окружающую среду, быть достаточно дешевыми.

Стерилизация облучением – -лучами, микроволновым излучением. Стерилизация -облучением используется для термолабильных твердых субстратов (торф и другие носители) при приготовлении товарных форм биопрепаратов (с азотфиксирующими микроорганизмами и др.).

Подготовка питательных сред

Отходы, обогащаемые кормовым белком – это сырье комплексного состава, которое может содержать органические и минеральные компоненты – источники углерода, азота, фосфора, серы, витамины, ростовые факторы, микроэлементы. Однако для получения продукта требуемого качества субстрат должен иметь определенную концентрацию источника углерода, соотношение С : N : P (влияет на выход биомассы, содержание в ней белка, липидов, фосфолипидов), степень чистоты, стерильность, ограниченное содержание токсичных веществ – тяжелых металлов и др. Поэтому обычно питательную среду готовят из органического субстрата и солей.

Как правило, соли служат источниками N, P, Mg, K, S, Na, Ca, микроэлементов, Fe, Zn, Mn и др. Кроме Na и Ca, а иногда и микроэлементов, в питательные среды добавляют все перечисленные элементы. Na, Ca и микроэлементы могут содержаться в необходимых количествах в природной воде и перерабатываемых отходах.

Азот добавляется в виде NH4+ (NH4Cl, (NH4)2SO4, NH4OH) или NH3. Нитраты используются реже, так как микроорганизмами азот нитратов усваивается после восстановления его в аммонийную и аминную формы, что требует затрат энергии и снижает выход продукта.

Фосфор вводится в ферментер обычно в виде H3PO4 или солей фосфорной кислоты: аммофоса, двойного суперфосфата и др. Суперфосфат – дешевый источник фосфора, однако он содержит много соединений фтора, который неблагоприятно действует на микроорганизмы и попадает в продукт, поэтому на предприятиях, как правило, контролируют уровень F– в сырье и продукте.

Kалий используется в виде K2SO4, KCl, иногда KOH. Mагний – в виде MgSO4. кальций – в виде CaCO3. Карбонат кальция часто служит буферным агентом для поддержания pH среды вблизи нейтральных значений.

Микроэлементы вводятся в виде сульфатов. Хлориды используются редко из-за корродирующего действия ионов Cl–. Остальные элементы присутствуют как примеси к основным минеральным солям.

В качестве источника минерального питания при переработке отходов обычно используются относительно дешевые удобрения невысокого качества (70% основного вещества). Однако в этом случае могут в большом количестве появляться шламы (соли Ca, Mg), которые воздействуют на технологические аппараты (режут, забивают трубопроводы), поэтому шламы необходимо отделять от раствора (обычно непосредственно в емкостях, где готовят растворы солей) и в дальнейшем вывозить в места складирования или утилизировать.

Как правило, питательные соли вводятся в среду культивирования с избытком (до 1,5–2 раз).

Титрующие агенты и пеногаситель. Пеногаситель (пропинол Б-400, адеканаль и др.) обычно добавляется в виде эмульсии и стерилизуется отдельно.

Если ферментация идет с потреблением азота в виде NH4+, то NH3 включается в клеточное вещество, а H+ выделяется в среду. Происходит ее подкисление. Подкисление возможно также при выделении органических кислот. В этом случае среду нейтрализуют введением NH4OH, реже NaOH, KOH. Используются также буферные реагенты (CaCO3), добавляемые в исходную среду культивирования. При использовании NH4OH в среде возрастает концентрация азота, меняется соотношение P : N, что может отразиться на росте и биосинтезе. При твердофазной ферментации сложно поддерживать необходимый pH внутри твердой фазы. В этом случае в качестве источника азота могут использоваться смеси аммонийных солей и мочевины.

Если в ходе ферментации наблюдается подщелачивание – при использовании нитратов или мочевины (NH2)2CO в качестве источника азота, органических кислот в качестве углеродного субстрата, то обычно среду подтитровывают

H2SO4, H3PO4.

Для снижения объема стоков и экономии питательных солей можно использовать рецикл культуральной жидкости на стадию ферментации. Однако из-за несбалансированного потребления катионов и анионов часть из них накапливается в среде культивирования. Одновременно накапливаются и продукты микробного метаболизма. При повышенных концентрациях метаболитов может наблюдаться ингибирование биосинтеза. Для решения этой проблемы из рециркулируемой жидкости необходимо удалять избыточные ионы, ингибиторы роста и биосинтеза. Однако обычно это сложный и дорогой процесс. Кроме того, при рецикле требуется стерилизовать возвращаемую культуральную жидкость, там накапливаются ионы тяжелых металлов. В таких случаях необходимо использовать сырье более высокого качества, что удорожает продукт. Таким образом, решение задачи снижения объема стоков и экономии питательных солей без увеличения суммарных затрат ведет к ухудшению качества целевого продукта. При использовании малосточной технологии с получением продукта высокого качества себестоимость последнего высока.

Для использования в технологическом цикле отдельно готовят растворы каждой соли с повышенной концентрацией – так легче определить концентрацию соли в растворе, концентрированные растворы легче хранить и проще избежать нежелательных реакций между солями (например, при смешивании сульфатов микроэлементов с фосфатами аммония или калия в осадок могут выпадать фосфаты микроэлементов). Если компоненты питательных сред взаимодействуют между собой при тепловой стерилизации, то их стерилизуют отдельно.

Плохорастворимые соли необходимо подкислять. Однако работа с подкисленными растворами требует использования более дорогих кислотостойких марок сталей. Можно повысить рН, если питательные соли быстро готовить и быстро перекачивать в ферментер, но в этом случае возрастают трудозатраты.

В технологическом процессе важно обеспечить постоянство концентраций минеральных компонентов в питательной среде. Если наблюдаются большие колебания концентрации солей в непрерывном процессе, то микроорганизмы должны постоянно адаптироваться к этим изменениям, что ухудшает их рост и технологические показатели процесса.

Приготовление посевного материала

Приготовление посевного материала предусматривает выращивание чистой культуры продуцента последовательно от штамма в пробирке до посевного аппарата (инокулятора).

Культуры микроорганизмов хранят в жизнеспособном состоянии на агаризованных средах (не более 3 мес). Более длительное хранение возможно в сухом виде (споры) на природном носителе (кварцевый песок, высушенное зерно); в лиофильно-высушенном состоянии (3–5 лет).

Размножение посевного материала для глубинного культивирования проводят в следущей последовательности:

пробирка качалочные первичный вторичный ферментер

Такой процесс постепенного размножения облегчает обеспечение стерильных условий и доминирование продуцента в популяции в случае нарушения стерильности на стадии промышленной ферментации, позволяет своевременно выявлять фаговые инфекции, падение активности продуцента. Таким образом экономится сырье, снижается доля бракованных ферментаций.

Обычно соотношения рабочих объемов аппаратов (площадей кювет) возрастают по ходу размножения как 1 : 10 – 1 : 20 (т. е. 5–10% посевного материала). Распространенные объемы ферментеров: 0,63 м3 6,3 м3 63 м3 (2 r = 6,3r).

Промышленный ферментер можно засеять сразу из колбы, но это нерационально, так как культура будет долго расти в большом объеме, что приведет к снижению производительности основного оборудования, росту эксплуатационных затрат, большей вероятности инфицирования. Для неасептических процессов при низкой дозе засева культура может вытесниться дикой микрофлорой.

Обеспечение аэробного ферментационного процесса кислородом

Подготовка воздуха в промышленных условиях включает его компримирование (сжатие),очисткуистерилизацию(дляасептическихпроцессов).Обычностепень утилизации кислорода из воздуха 1–20%, т. е. в лучшем случае используется 4% воздуха,поэтомунеобходимопрокачиватьзначительноеколичествовоздухачерез слойжидкости(приглубинномкультивировании)инеобходиммощныйкомпрессор,еслидляаэрациижидкостивферментереиспользуетсябарботаж.Васептической ферментации на выходе из биореактора избыточное давление воздуха должно составлять около 0,03 МПа с целью исключения попадания инфекции извне. На входе давление поддерживается в диапазоне 0,2–0,3 МПа.

Если величина μX высокая, низкий KV, высокий YO2/X, то COX низкая и соответственно рост микроорганизмов лимитируется подачей кислорода. Повысить COX можно, увеличивая COX*, например, аэрацией среды воздухом, обогащенным кислородом или увеличением давления в ферментере, а также повышая KV путем использования более эффективных режимов работы, аэрирующих и перемешивающих устройств. Энергозатраты на перемешивание и аэрацию существенно растут с увеличением KV. Кроме того, существует определенный предел, выше которого повышать KV уже невозможно, даже при использовании наиболее эффективных систем аэрации и перемешивания.

Лимитирование роста по кислороду очень часто наблюдается в процессах, в которых биомасса растет с высокой удельной скоростью роста (μ > 0,2 ч–1 ) и высокой концентрацией активно растущих клеток (Х > 3–5 г/л).

Большие усилия для обеспечения кислородом требуются:

при росте на субстратах с низким содержанием кислорода в молекуле легкодоступного субстрата (н-алканы, CH4 , этанол, метанол, жиры); в этом случае YO2 / X высокий;

при ферментации на среде с высокой вязкостью, например, если образуется мицелий или выделяются полисахариды в среду культивирования (сложно обеспечить высокий KV);

при росте культур, склонных образовывать агрегаты и флокулы (сложно обеспечить высокий KV и доступ кислорода внутрь агрегатов);

при иммобилизации микроорганизмов на поверхности твердых носителей и сред (рост и биосинтез лимитируется переносом кислорода через пограничный слой между жидкой и твердой фазами).

Для повышения интенсивности массопереноса кислорода в ферментере может использоваться ряд способов.

1.Совершенствование конструкции перемешивающего устройства и увеличение скорости оборотов мешалки (при глубинном и глубинном гетерофазном культивировании).

При получении продуктов, обогащенных кормовым микробным белком, конструкция биореактора с барботажем воздуха без мешалки применяется редко, поскольку не позволяет обеспечить требуемые массообменные характеристики в биореакторе.

Конструкция ферментера с барботажем с эрлифтным устройством применима для не очень интенсивных процессов с относительно невысоким содержанием конвертируемого субстрата в среде, например, при выращивании дрожжей на гидролизатах древесины (с содержанием углеводов в исходном сусле 12–16 г/л). Достоинство этого способа – простота конструкции и меньшие сложности с обеспечением

пространенным крупногабаритным аппаратом является аппарат с общим объемом около 100 м3, поскольку его еще можно перевезти по железной дороге. При большем объеме монтаж ферментера ведут на месте.

Материалы для ферментеров: легированная нержавеющая сталь. Обычные марки стали, черный чугун, эмалированный чугун не используются.

Верхняя крышка ферментера обычно приваривается (в отличие от химических аппаратов) – для обеспечения герметичности (фланцевые соединения не обеспечивают герметичности, так как прокладки пробиваются, особенно под давлением при стерилизации). В ферментере имеется люк (монтируется на болтах), через который можно пролезть внутрь для монтажа теплообменника, барботера, мешалки, чистки поверхностей внутри ферментера.

Порядок запуска ферментера в асептических условиях.

1.Осуществляют стерилизацию аппарата. Для этого заливают воду, подают пар либо в рубашку, либо в ферментер и пар в обвязку. Выдерживают несколько часов, затем опорожняют, продувают стерильным воздухом.

2.Загружают стерильную питательную среду (воду, источники углерода, макро- и микроэлементы).

3.Устанавливают рабочую температуру (26–55 °С) подачей холодной воды в рубашку.

4.Вносят стерильно посевной материал.

5.Начинают подавать чистый воздух (с температурой не выше 60–90 °C). При повышении температуры воздуха наблюдается повышенный брызгоунос (до 50% среды за ферментацию). Вариант возврата унесенных питательных веществ не предусматривается из-за необходимости сохранения асептических условий.

Охлаждение ферментера. Выделение тепла в процессах биосинтеза и перемешивания приводит к нагреву ферментационной среды, поэтому, как правило, требуется охлаждение ферментера.

На большинстве ферментеров имеются рубашки. Если поверхности теплообмена не хватает, то монтируют дополнительные змеевики. Часто используют наружное орошение. Летом могут возникнуть проблемы с охлаждением, так как температура холодной воды (в месте водозабора) растет, разность температур по обе стороны теплообменной поверхности уменьшается и соответственно падает скорость теплоотвода, в связи с этим возможен перегрев ферментационной среды с превышением температуры выше оптимальной на 8–10 °С. В таких случаях требуется захолаживание воды или использование в качестве хладоагента рассола CaCl2. Затраты на охлаждение ферментера в этом случае резко повышаются.

В технологической схеме должны быть предусмотрены резервуары для промежуточных потоков – стерильных сред и ферментированной среды. Объем и количество резервуаров рассчитываются исходя из технологического потока и допустимых сроков хранения среды в резервуаре.

Если культуральную жидкость нужно долго хранить в промежуточных емкостях, то ее захолаживают (до 10 С), чтобы не развивалась посторонняя микрофлора.

Если по какой-либо причине наблюдается низкая активность продуцента (низкая конечная концентрация продукта), то такая ферментация является бра-

кованной. В этом случае приходится все содержимое ферментера сливать в трап и далее на очистные сооружения. Обычно доля таких ферментаций – не более нескольких процентов.

Чистка и мойка оборудования. Можно осуществлять чистку и мойку паром, однако это не совсем удобный метод – поверхности сложно очистить. Чаще используется мойка с химическими средствами. Они должны быть избирательными, инертными к материалу оборудования. Часто для мойки используется щелочь, сода с концентрацией 10–15%, затем оборудование и коммуникации промываются водой. Отработанный раствор при необходимости стерилизуется. В технологической схеме должна быть предусмотрена возможность чистки, мойки и дезинфекции всех аппаратов и трубопроводов.

3.2.1.2. Выделение и концентрирование биомассы и белковых веществ

При переработке жидких отходов в кормовые продукты глубинным культивированием биомассу одноклеточных организмов отделяют от ферментированной среды (бесклеточной, культуральной жидкости) и концентрируют различными методами или сгущают и сушат вместе с остатками субстрата и продуктами жизнедеятельности. При гетерофазном глубинном культивировании биомассу выделяют совместно с твердой фазой.

Для выделения клеток микроорганизмов из жидкой среды могут использоваться различные методы (см. разд. 1.8).

Декантация (седиментация), гравитационное уплотнение. В отличие от процессов биологической очистки сточных вод, в которых активный ил осаждается во вторичных отстойниках или на стадии предварительного уплотнения активного ила, в технологиях микробиологического синтеза эти способы применяются редко из-за низкой производительности, поскольку плотность микроорганизмов близка к плотности среды культивирования. Иногда для ускорения осаждения биомассы в среду добавляют коагулянты и флокулянты, способствующие образованию крупных флокул микроорганизмов и их осаждению. Сгущению активного ила, предназначенного для использования в качестве кормовой добавки, способствует введение минеральных веществ с коагулирующими свойствами, кормовых дрожжей р. Candida, биофлокулянтов, получаемых модификацией активного ила. Добавление дрожжей благоприятствует агрегированию хлопьев и увеличению скорости их осаждения. Аналогичный вариант, но с добавками активного ила, возможен и при выделении дрожжей из отработанной культуральной жидкости. Плотный осадок образуется при высоких концентрациях минерального коагулянта при совместном отстаивании суспензии активного ила и дрожжей в гравитационном поле.

Декантация и уплотнение позволяют уменьшить объем суспензии микроорганизмов, что приводит к снижению затрат на последующих стадиях переработки. Осадок после отстаивания можно направить в сепаратор для дополнительного сгущения микробной биомассы, а сгущенную биомассу подать в сушилку.

Фильтрация. Используется достаточно широко на конечной стадии сгущения для выделения крупных мицелиальных форм микроорганизмов, дрож- жей-сахаромицетов. Применяются барабанные и ленточные прессы (при фильтрации кормового продукта, содержащего твердую фазу), фильтр-прессы, нутч-фильтры (при малом объеме жидкости). Фильтрация с намывным слоем возможна для выделения микроорганизмов совместно с остатками твердой фазы субстрата после гетерофазного культивирования. В качестве намывного слоя выступает твердая фаза переработанного субстрата. Перед фильтрацией суспензии микробных клеток возможно добавление древесных опилок несмолистых пород деревьев, древесной муки, диатомита, цеолитов, других присадочных материалов – инертных легкофильтрующихся веществ, которые создают крупнопористую структуру осадка. Этот прием улучшает фильтруемость и одновременно может быть использован для балансирования кормовых свойств получаемых продуктов.

Бактериальные микроорганизмы имеют малые размеры и для них обычные фильтры непригодны. В этом случае можно использовать микрофильтрацию и ультрафильтрацию.

Во всех методах фильтрации проблемой является быстрое забивание фильтров и мембран, что приводит к резкому падению (в десятки раз) их производительности. Приходится прикладывать большие усилия для поддержания удовлетворительных рабочих характеристик фильтров, многократно увеличивать площадь фильтрующей поверхности и габариты установок. Для повышения скорости фильтрации в суспензию микроорганизмов добавляют коагулянты или флокулянты, нагревают ее. Попадание в суспензию смолистых, слизистых и коллоидных примесей, масел и жиров ухудшает фильтруемость суспензии.

Центрифугирование и сепарация широко используются на биотехнологических предприятиях на первом этапе концентрирования микроорганизмов, если ферментационная среда не содержит остатков твердой фазы, абразивных примесей. Достоинства этого способа: простота, экономичность, возможность автоматизации. Недостаток – частая остановка центрифуг и сепараторов для мойки из-за наличия в суспензии частиц песка, остатков твердой фазы субстрата и т. п. Крупные микроорганизмы (дрожжи) отделяются легко, бактерии – сложнее. Для их отделения необходимо увеличивать число оборотов, диаметр ротора, что ведет к резкому увеличению затрат энергии. В промышленности для сгущения биомассы микроорганизмов наибольшее распространение получили тарельчатые сепараторы. Варианты организации сепарации: одноступенчатая, многоступенчатая (обычно двухступенчатая). Между ступенями сепарации возможен нагрев сепарируемой жидкости с биомассой. Это приводит к уменьшению вязкости среды и, следовательно, к большей производительности сепаратора, а также к увеличению степени отмывки клеток микроорганизмов от остаточных примесей, например капелек жира. После одноступенчатой сепарации концентрация микроорганизмов повышается с 1–2 до 3–6%. После двухступенчатой – до 15%.

В ходе сепарации небольшая часть микроорганизмов может уноситься с потоком осветленной культуральной жидкости. Потери дрожжей после сепарации

в результате уноса обычно не превышают 1–2% от всего количества биомассы. Бактерии хуже сепарируются из-за своих размеров, что приводит к повышенному уносу биомассы с потоком осветленной культуральной жидкости со стадии сепарации. В этом случае, если в схеме не предусмотрен рецикл отработанной культуральной жидкости на ферментацию, необходимы дополнительные сепараторы для ее доочистки.

Флотация. Используется на первой стадии сгущения биомассы. Достоинства флотационного сгущения – простота аппаратурного оформления, незначительная продолжительность процесса, удовлетворительные показатели сгущения суспензии (степень сгущения 3–5). Разделение идет в односекционных или многосекционных флотаторах. Флотация может происходить в ферментере при образовании пены. Пена содержит повышенную концентрацию микроорганизмов. Содержание биомассы в пенном слое достигает 30–100 г/л (по сухим веществам).

Флотаторы используются в производстве дрожжей на гидролизатах древесины. В этом производстве конечная концентрация дрожжей в ферментационной среде невысока (не более 8–10 г/л). При невысокой концентрации биомассы на первой стадии выделения более рационально использовать флотационный метод, а не сепарацию. Как правило, отделение или концентрирование микроорганизмов не достигается только флотацией. Обычно после флотации предусмотрена сепарация.

Бактериальные микроорганизмы плохо флотируют, дрожжи – лучше. Для повышения флотируемости частиц и клеток в среду можно вводить дополнительные реагенты (ПАВ и др.).

В промышленности наиболее широко применяют способ напорной флотации (см. рис. 1.94). Постферментационную среду с микроорганизмами насыщают под давлением 0,25–0,65 МПа воздухом в сатураторе в течение нескольких минут. При снижении давления до атмосферного во флотационной камере начинают выделяться мельчайшие пузырьки воздуха, которые флотируют содержащиеся в воде частицы. Образовавшийся пенный слой сфлотированной биомассы механически удаляется из камеры в приемник суспензии.

Недостаток флотации – высокий вынос нефлотированных клеток микроорганизмов (0,5–1,5 г/л) и потери биомассы.

Электрофлотация, при которой пузырьки газа образуются в результате электролиза воды, также может быть использована для сгущения микробной биомассы. При обработке суспензии бактерий электрофлотацией степень сгущения составляет 3–5 при исходной концентрации 0,6–1,0% абсолютно сухих веществ, а энергозатраты – около 1–2 кВт·ч на 1 м3 исходной суспензии. Наибольшее влияние на процесс электрофлотации оказывает плотность тока.

Коагуляция и флокуляция применяются для улучшения седиментационных, фильтрационных и флотационных характеристик клеток микроорганизмов. Возможны реагентные (химические), безреагентные (физические) и комплексные (химические и физические) методы обработки.

При снижении или увеличении pH, под воздействием повышенной температуры или химических веществ (электролитов-коагулянтов, флокулянтов, ПАВ) свойства поверхности клеток модифицируются, они агрегируют, обра-

зуют хлопья, флокулы. Медленное и равномерное перемешивание суспензии увеличивает объем, массу и способность к слипанию образующихся агрегатов. Такие агрегаты легче осаждаются и отделяются от воды, удельное сопротивление их при фильтрации ниже, флотируемость повышается. Дальше их либо отфильтровывают, либо осаждают или сепарируют, либо флотируют и отделяют другими методами.

При получении кормового и тем более пищевого продукта на основе микробной биомассы реагентная обработка не должна ингибировать рост микроорганизмов при введении в ферментер, добавляемые реагенты должны действовать эффективно в небольших количествах, быть нетоксичными или легко отмываться от клеток.

Седиментационные характеристики, сепарируемость микробной суспензии и способность к обезвоживанию можно существенно улучшить предварительным нагревом до 65–85 °С и термореагентной обработкой, при которых происходит денатурация белковых веществ и клеточных структур.

Коагуляция используется и в случаях, когда целевой продукт – внеклеточные метаболиты, а не клетки микроорганизмов. Тепловая коагуляция применяется, например, в технологии получения белка из клеточного сока растений. Недостаток тепловой коагуляции – при высокой температуре может наблюдаться лизис (плазмолиз) клеток, что приводит к потере биологически активных веществ.

Вакуум-выпарка используется на конечных стадиях концентрирования продукта. Режимы вакуум-выпарки выбирают такие, чтобы сгустить продукт, удалить воду, сохранив качество продукта, а иногда и жизнеспособность клеток (в производстве пекарских дрожжей, различных биопрепаратов на основе живых клеток микроорганизмов). Поэтому температура упаривания должна быть не выше 90 °С, а если требуется сохранить жизнеспособность микроорганизмов, то еще меньше и соответственно при использовании более глубокого вакуума. Содержание сухих веществ в упаренной после вакуум-выпарки суспензии составляет 20–30%.

На крупнотоннажных предприятиях распространены многокорпусные вы- куум-выпарные установки (ВВУ) с 2–4 ступенями с разным давлением и температурой. В этом случае более рационально используется тепло, необходимое для испарения влаги. Пар используется с давлением 0,4–0,6 МПа. По ходу ступеней интервал температур упариваемой жидкости меняется от 90–100 до 50–60 °С. Ниже 50 °С вакуум-выпарка экономически невыгодна.

Проблемой вакуум-выпарки является налипание органических веществ на стенки камеры, поэтому ВВУ приходится регулярно чистить (1 раз в месяц). Для этого используется промывка горячим раствором 4–6% NaOH или 4–6% раствором HNO3 в течение около 12 ч, что приводит к усилению коррозии поверхностей, дополнительным затратам, увеличивает объем жидких стоков.

Конечный этап концентрирования кормового продукта – сушка. Главное, что определяет условия сушки – это сохранение кормовых качеств продукта, его усвояемости и биологической ценности.

Сушка вальцеванием имеет низкую производительность, для нее характерно налипание продукта на барабаны, до 15% потерь продукта, однако использова-

ние ее целесообразно при получении продукта с твердой фазой (после твердофазной или глубинной гетерофазной ферментации).

Лиофильная сушка используется для сушки термолабильных продуктов и получения живых клеток (процесс длительный и плохо автоматизированный).

Распылительная сушилка имеет высокую производительность, большую скорость испарения. Частицы высушиваемого материала не перегреваются, так как время контакта материала с теплоносителем невелико, что приводит к меньшим потерям продукта по сравнению, например, с вальцовой сушилкой. Используются распылительные сушилки либо с форсункой, либо с быстро вращающимся диском. Недостаток форсунок – быстрое засорение и эрозия поверхности (ямки)

вместе, куда попадает струя продукта из-за неидеального распыления форсункой. Диск также эродируется, что приводит к неравномерному распылению.

Другие конструкции сушилок: струйного типа, с инертным псевдоожиженным носителем не получили широкого распространения в производстве кормовых продуктов.

После сушки продукт должен содержать не более 8–10% влаги. В этом случае он может длительно храниться без существенного ухудшения качества.

Товарная форма кормового продукта в виде порошка (после распылительной сушилки) не всегда удобна (порошок пылит, животные плохо его поедают), поэтому продукт может дополнительно гранулироваться.

Для получения гранул порошок увлажняется, паста поступает в гранулятор, проходит через фильтры, разрезается и затем заново подсушивается. Грануляция может также происходить при сушке в кипящем слое.

Если все клетки микроорганизмов необходимо инактивировать, то часто используются плазмолиз и пастеризация (перед сушкой). При плазмолизе клетки отмирают и лизируют. Температура плазмолиза 60–80 °С, продолжительность обработки – десятки минут. Если в технологической схеме предусмотрена вакуум-выпарка, то плазмолиз обычно не нужен, так как клетки отмирают непосредственно в ВВУ.

Пастеризацией инактивируют вегетативные клетки микроорганизмов при 70–90 °С. Для инактивирования спор среду сначала обрабатывают при температуре 85–90 °C. После чего ее выдерживают при температуре роста микроорганизмов до прорастания неинактивированных спор и вновь нагревают.

Фасовка и упаковка. При фасовке необходимо обеспечить минимальный контакт обслуживающего персонала с продуктом. В случае пылящего продукта используют вытяжку с циклонными сепараторами, с помощью которых пыль продукта собирается в бункеры и возвращается на упаковку. Сухой продукт фасуют в количестве до 25–30 кг в 2- или 3-слойные мешки из бумаги, полиэтилена, в банки, просто навалом. Жидкий продукт разливают в цистерны, бидоны, другие емкости.

Продукт с влажностью 70–80% и живыми микроорганизмами выпускается

ввиде пасты, прессованных брикетов в меньшей расфасовке, которые хранятся при низких температурах.

Иногда в кормовой продукт перед выпаркой, сушкой или упаковкой вносят дополнительные компоненты: питательные добавки, стабилизаторы, антиокис-

лители, компоненты, предохраняющие слеживаемость препарата, различные твердые наполнители и носители и т. д. Это необходимо для стандартизации продукта, обеспечения оптимальной кормовой ценности и других потребительских характеристик, необходимых технологических свойств при его скармливании.

Примеры схем выделения:

глубинное культивирование на жидких средах а) содержание биомассы в конце ферментации невысокое (0,5–1%):

флотация сепарация вакуум-выпарка сушка б) содержание биомассы в конце ферментации высокое (1,5–2,5%):

сепарация I сепарация II вакуум-выпарка сушка

глубинное гетерофазное культивирование фильтрация пастеризация сушка

или вакуум-выпарка сушка

Флотацией, фильтрацией и сепарацией удаляется б;ольшая часть воды из концентрируемой суспензии микроорганизмов при существенно меньших энерго- и теплозатратах, чем при вакуум-выпарке и сушке. Иногда возможен возврат части образующихся фильтрата или фугата на стадию подготовки питательной среды или ферментации. В этом случае уменьшаются объемы потребляемой воды и жидких стоков.

На небольших установках для экономии капитальных затрат после сепарации продукт могут сразу подавать на распылительную сушку, либо вместо сепарации используется схема вакуум-выпарка – распылительная сушка.

Такие методы выделения, как ионный обмен, экстракция, электродиализ, осаждение, ультрафильтрация, хроматография, используемые при выделении и очистке биологически активных веществ, при получении кормового белка, применяются редко. Они высокозатратны и целесообразны лишь при получении продуктов пищевого назначения: белков, аминокислот, витаминов.

3.2.1.3. Технико-химический контроль и обеспечение качества продукции

Технико-химический контроль – это работа, связанная с выполнением физических, физико-химических, химических, микробиологических методов анализа по месту по всей технологической линии в цеховых и заводских условиях.

Содержание технико-химического контроля на производстве определяется нормативно-технической документацией и регламентом завода. Нормативнотехническая документация определяет показатели и состав любого вещества сырья, полупродуктов, продуктов. Различают:

ГОСТы (государственные стандарты) на вещества;

ОСТы (отраслевые стандарты); ТУ (технические условия) – временные документы, действующие до

разработки и утверждения ОСТа и ГОСТа.

Физико-химические параметры

11)Температура, рН, давление, расход питательной среды и воздуха, рО2 и другие параметры ферментационной среды.

12)Поток отходящих газов из ферментера, их состав. Важны соотношение

между О2 и СО2, концентрация летучих продуктов метаболизма, концентрация микроорганизмов (продуцентов и сопутствующих).

Стадии выделения.

13)Состав и концентрация культуральной жидкости, концентрация микроорганизмов.

14)Коэффициент сгущения – отношение концентрации биомассы или другого целевого продукта к их концентрации в исходной постферментационной жидкости.

Сушка.

15)Влажность целевого продукта после сушилки.

16)Содержание микроорганизмов и белка в газовоздушных выбросах.

Готовый продукт.

17)Все показатели, указанные в нормативно-технической документации:

–содержание основного вещества и примесей (особенно тяжелых металлов, металломагнитных примесей, зольность продукта и др.);

–содержание продуцента и загрязняющей микрофлоры, спор, токсинов;

–отсутствие живых клеток микроорганизмов, или наоборот – титр живых клеток.

Сточные воды.

БПК, ХПК, содержание аммонийного и нитратного азота, фосфора, наличие санитарно-показательной микрофлоры.

Для качества кормового продукта важно:

минимальное содержание посторонней микрофлоры;

максимальное содержание протеина и оптимальный состав незаменимых аминокислот;

минимальное содержание вредных примесей.

Из технологических мер для уменьшения содержания посторонней микрофлоры эффективны следующие:

поддержание асептических условий;

использование как можно более простых сред; наличие витаминов, аминокислот, других органических примесей увеличивает содержание сопутствующей микрофлоры; в субстрате не должно быть много мертвых клеток микроорганизмов, которые могут служить источниками факторов роста;

использование высоких скоростей разбавления (D, для проточной ферментации); культуральные штаммы выращивают при D 0,2–0,25 ч–1; удельная скорость роста дикой микрофлоры обычно ниже (0,1–0,15 ч–1), она не удерживается в ферментере при D > 0,2 ч–1;

обеспечение кислородом процесса, т. е. использование ферментеров с высокими массообменными характеристиками; если концентрация

1 В одноступенчатом реакторе в проточных условиях D = v/V, в хемостатном режиме D = μ.

350 Глава 3

О2 в среде падает, то для достижения необходимой степени конверсии субстрата в биомассу необходимо уменьшать скорость разбавления, что приводит к увеличению численности посторонней микрофлоры;

при культивировании дрожжей ведение процесса в закисленной среде (pH 4,2–4,6); дрожжи при этом рН растут хорошо, а рост большинства бактерий угнетается.

Содержание протеина в биомассе дрожжей обычно составляет от 30 до 60%; в биомассе бактерий – до 80%. К падению содержания протеина приводят:

увеличение температуры ферментации, особенно в летнее время, когда из-за повышения температуры охлаждающей воды теплоотвод из ферментера затруднен (использование термофильных штаммов не устраняет проблему, так как они содержат меньше белка);

недостаточное обеспечение процесса биосинтеза кислородом;

переход на азотдефицитную среду; важно соотношение С : N и N : P (оптимальное соотношение N : P2O5 = 2–1,5 : 1).

Уменьшение содержания вредных примесей в продукте достигается: более тщательной предобработкой питательных субстратов;

использованием минеральных солей с низким содержанием примесей (но их стоимость более высокая);

промывкой биомассы на стадии выделения; снижением рецикла отработанной (бесклеточной) культуральной жид-

кости, что, однако, увеличивает количество сточных вод.

3.2.1.4. Принципы организации малоотходного производства

На приведенной на рис. 3.9 (стр. 348) технологической блок-схеме условного микробиологического производства показаны основные пути создания малоотходного производства (обозначены римскими цифрами) с получением продуктов А, Б, В, Г.

Источники отходов и загрязнений производства:

1.Охлаждающая вода и конденсат пара с теплообменников.

2.Промывные воды и растворы.

3.Побочные продукты культуральных жидкостей.

4.Газовоздушные выбросы (в основном из ферментеров, сушилок).

5.Стоки с ионообменных колонн, пермеаты или концентраты мембранного разделения, маточные растворы после кристаллизации и т. п.

6.Химикаты и растворители со стадий выделения.

7.Сточные воды.

8.Активный ил очистных сооружений.

9.Шламы с солеподготовительных отделений и отходы со стадии подготовки субстрата (лигнин в производстве на гидролизатах древесины).

Варианты утилизации и уменьшения отходов и стоков:

1. Создание замкнутого цикла водопотребления путем:

а) охлаждения оборотной воды с теплообменников в градирнях (или в холодильных агрегатах) и ее рецикла в производство (способ I);