вопросы в пдф / вопрос 50

Вопрос№50

Основные достижения биотехнологии. Генная инженерия.

Генная инженерияэто совокупность приемов или методов позволяющих путем операций in vitro перенести генетический материал от одного организма (донора) к реципиенту.

Объект исследования: ген

Цели:

1.Фундаментальная: изучение молекулярных механизмов функционирования генетического аппарата эукариот. Задачи:

- получение путем бактериологического синтеза ряда фармакологических препаратов обладающих видовой специфичночтью; - создание диагностикумов; - получение вакцин нового поколения и т.д.

2.Прикладная: выделение отдельных генов и их молекулярное клонирование.

Теоретические основы генной инженерии:

1.Молекулярные основы матричного синтеза;

2.Исследование рекомбинации нуклеиновых кислот.

3.Обнаружение в бактериальных системах внехромосомальных автономнореплицирующих кольцевых молекул ДНК.

4.Получение первой эндонуклеазы (рестриктазы) Смитом и Элли 1970г.

Возможности Г.И.

1.Можно скрещивать индивидуальные гены любых видов.

2.Можно управлять процессом рекомбинации.

3.Можно предсказать результат.

Этапы генноинженерных работ:

1.Получение нужного гена

2.Введение нужного гена в генетический элемент (вектор) способный к репликации.

3.Введение гена в составе вектора в организм-реципиент

4.Идентификация при помощи радиоактивных зондов клеток, которые приобрели желаемый ген.

5.Создание благоприятных условий для экспрессии нужного генома в новых рекомбинантных органихмах.

6.Отделение, отчистка и модификация биотехнологических продуктов.

Ферменты Г.И.

1.Рестриктазы.

1.Специфические (80)- осуществляют гидролиз в строго определенном сайте (4-6 и более азот. оснований) – продукт – образование фрагментов ДНК с «липкими» концами.

2.неспецифические (>200) – образование фрагментов с тупыми концами.

2.Лигазы – сшивка.

3.Обратная транскриптаза – ревертаза.

4.ДНК –полимераза I (фрагмент Кленова).

Методы создания липких концов:

1.Метод линкеров:химический синтез 8-10 нуклеотидных звеньев, взаимокомплиментарных на обоих концах тупых звеньев.

2.Коннекторная технология: с помощью концевой нуклеотидтрансферазы к 3’-концу одного фрагмента присоединяется гомополи нуклеотид (полиА), а к другому олигонуклеотид (полиТ).

Векторы:

Свойства:

1.Небольшие по размерам и молек. массе.

2.должны содержать специфические участки для расщепления рестриктаз.

3.должны иметь маркеры для max селекции рекомбинантных клеток.

Классификация:

1.плазмиды. Многие плазмиды содержат гены, которые придают бактериям фенотипические признаки (устойчивость к антибиотикам, токсинам).Распространенным является искусственно синтезированная плазмида pBR 322, которая содержит 2 фрагмента антибиотика( ген тетрациклина и ген ампицилина). В еѐ состав входит pst -1 –сайт рестрикции.

2.ДНК бактериофагов. В отличии от плазмид способны нести 10 -20 тыс. пар нуклеотидов. Фаг λ – 2х цепочечная ДНК, 49 тысяч пар нуклеотидов. Может нормально функционировать при потере 50% собственной ДНК.

3.космиды. Плазмиды, которые содержат специфические участки cosсайты, необходимые для упаковки ДНК фага λ. Допустимые вставки в cos-сайты 30-50 тысяч пар нуклеотидов.

Основные клетки-реципиенты:

1.E.coli

2.Bacillus suptilus

3.клетки растений

4.клетки животных.

Способы получения генов:

1.Химикоферментативный: Химический синтез от 8-16 одноцепочечных олигонуклеотидов синтезируемых твердофазным методом.

2.Метод обратной транскрипции.

1.При обратной транскрипции эукариотической мРНК используется факт, что на еѐ 3’конце содержится полиА. Благодаря этому в качестве затравки для ревертазы используется полиТ последовательность. Образование 2хцепочечной затравки позволяет ревертазе по мРНК синтезировать кДНК. В конце она образует «шпильку».

2.Удаление мРНК из ДНК-РНК-гибрида путем добавления NaOH или рибонуклеаз.

3.Добавление фрагмента Кленова и нуклеотидов для построения 2х цепочечной кДНК. Затравка – образовавшаяся шпилька.

4.Удаление «шпильки» после обработки S1-нуклеазой.

3.Метод «дробовика» Предусматривает фрагментацию ДНК.

4.Использование мелкощепящих неспецифич. рестриктаз.

5.УЗ-обработка

6.использование физических методов.

Образуются фрагменты ДНК молекул. массой менее 10-20 тыс. кДа. Полученные фрагменты встраиваются в различные вектора.

Успехи генной инженерии:

1978г.-производство инсулина США, соматотропина, лейкоцитарного интерферона.

В настоящее время получен: брадикинин, уратострин, интерлейкин, факторы некроза опухоли.