КНОРРЕ_3227

субстрат—NH- Gly76

I

Lys63

I

Lys48—NH—Gly76

I I

Lys29 Lys63

I +

NH3+

Lys48—N H -Gly76

Рис. 57. Тандем из нескольких остатков убиквитина, связанный субстратом. Но­ мера соответствуют остаткам аминокислот, которые участвуют в модификации суб­ страта (Gly76) и в формировании тандема (Gly76 и Lys48)

В некоторых специальных случаях постгрансляционная модификация со­ стоит в галогенировании белков. Важнейшим из этих процессов является ио­ дирование белка тиреоглобулина, который является источником гормонов щитовидной железы (гл. 17).

Рассмотренные группы постгрансляционных модификаций боковых ра­ дикалов обеспечивают функционирование белков. Наряду с этим некоторые модификации существенны для формирования конечной пространственной структуры белка. Поскольку в поддержании конформационной стабильности свернутой полипептидной цепи существенную роль играют S-S-мостики, об­ разованные двумя остатками цистеина, важной посттрансляционной моди­ фикацией является окисление SH-групп. Число таких мостиков у различных белков варьирует в широких пределах. Например, в молекуле панкреатиче­ ской рибонуклеазы имеется четыре мостика, у сывороточного альбумина че­ ловека - 16. Мостики в нативных белках образуются между строго опреде­ ленными парами остатков цистеина, причем далеко не всегда между бли­ жайшими по цепи. Например, в панкреатической РНКазе существуют сле­ дующие пары связанных между собой остатков: Cys-26 - Cys-84, Cys-40 - Cys-95, Cys-58 - Cys-110, Cys-65 - Cys-72.

Дисульфидными мостиками часто связаны между собой различные субъ­ единицы белка, обладающего четвертичной структурой. Например, как было показано на рис. 48, дисульфидными мостиками связаны между собой легкая

и тяжелая цепи иммуноглобулина и два Fc-фрагмента этого четырехсубъединичного белка.

Посттрансляционной модификацией, необходимой для образования не­ обходимой пространственной структуры фибриллярных белков, является гидрокеширование. В основном этой модификации подвергается предшест­ венник коллагена - основного белка соединительной ткани.

Реакция происходит по остаткам аминокислот, не являющимся нуклео­ филами: СН2-группам пролина, лизина и аспарагина с образованием остатков соответственно 3-гидроксипролина, 4-гидроксипролина, 5-гидроксилизина и 3-гидроксиаспарагина катализируется железосодержащими монооксигеназами подподкласса К.Ф. 1.14.16.

ОН

но,

Av~NH

О

Важное функциональное значение имеет присоединение к белкам остат­ ков олигосахаридов (гликозилирование), превращающее белки в гликопро­ теиды. Процесс является ферментативным и будет рассмотрен в § 13.5.

Однако наряду с описанными ферментативными процессами в некоторых случаях белки подвергаются неферментативным модификациям. Белки плаз­ мы крови находятся в контакте с глюкозой, и аминогруппы остатков лизина этих белков могут образовывать основания Шиффа с альдегидными группа­ ми присутствующих в линейной форме молекул глюкозы. Этот процесс часто называют гликированием, чтобы отличить его от многочисленных фермента­ тивных процессов образования гликопротеинов, которые рассматриваются в § 16.5.

Возможно, что первая стадия не абсолютно специфична, и некоторые из этих ферментов образуют аминоациладенилат с гомоцистеином, который внутримолекулярно легко превращается в тиолактон гомоцистеина.

+

H3N-CH-COCr +

аденозилгомоцистеиназа

КФЗ.З.1.1

ОН ОН

нзй-сн-соо-

* I

SH

(СН2)4

I

^NH-CH-CO^

+

(СН2)4

I

'A/'NH-CH-CO'A/'

Рис. 58. Образование тиолактона гомоцистеина и его реакция с остатком лизина белка

Как видно из рис. 58, модификация белка этим тиолактоном приводит к появлению у белка дополнительной SH-группы. Напомним, что такой же результат получается при действии на белки тиолана (§ 9.2).

Глава 8. Первичная структура пептидов и белков

§ 8.1. Общие принципы установления первичной структуры белков. Специфическая фрагментация полипептидных цепей

Задача установления первичной структуры белков является менее мас­ штабной, чем установление первичной структуры геномов. Если в случае ге­ номов речь идет о секвенировании последовательностей, состоящих из сотен миллионов нуклеотидов, то при рассмотрении белков в большинстве случаев приходится иметь дело с последовательностями, состоящими из нескольких сотен аминокислотных остатков, в редких случаях превышающих тысячу. Некоторым осложнением является наличие у ряда белков четвертичной структуры, т. е. наличие в них нескольких полипептидных цепей. Это ослож­ нение преодолевается достаточно просто. Вопрос о четвертичной структуре белков рассматривается в § 9.2.

Первичную структуру белков можно определить двумя способами:

1)с помощью генетического кода по расшифрованной нуклеотидной по­ следовательности кодирующей мРНК или соответствующего гена (в послед­ нем случае после установления структуры экзонов);

2)путём непосредственного анализа аминокислотной последовательности.

Вкачестве иллюстрации первого подхода можно привести выявление му­ тации в гене, кодирующем p-цепь гемоглобина, которая приводит к тяжелому заболеванию - серповидноклеточной анемии. На участке генома, где проис­ ходит мутация, на транскрибируемой нити кодон СТС заменен на САС, что приводит к замене тринуклеотида GAG в мРНК на тринуклеотид GUG. В со­ ответствии с генетическим кодом это приводит к замене остатка глутамино­ вой кислоты на остаток валина, что как раз и является причиной изменения свойств гемоглобина (рис. 59).

Непосредственное секвенирование белков имеет несколько этапов:

а) количественный анализ гидролизата для определения аминокислотного состава белка и мольного соотношения входящих в него аминокислот;

б) определение с помощью подходящего физического метода молекуляр­ ной массы белка для вычисления количества всех присутствующих амино­ кислотных остатков;

в) определение количества входящих в молекулу полипептидных цепей либо с помощью хроматографического или электрофоретического разделе­ ния, либо посредством количественного анализа остатков, содержащих ами­ ногруппу (N-конец) и карбоксильную группу (С-конец);

г) разделение цепей, если их несколько, с учетом, что эти цепи могут

Нормальный Мутантный глобиновый ген глобиновый ген

(р-цепь)

Рис. 59. Схема мутации в p-цепи гемоглобина, приводящей к серповидноклеточ­ ной анемии

быть связаны либо ковалентно, например, посредством дисульфидных мос­ тиков, либо нековалентно, образуя четвертичную структуру;

д) расщепление каждой цепи специфическими методами на фрагменты, в которых удобно анализировать последовательность (в связи с тем, что су­ ществующие методы собственно секвенирования не позволяют провести его на целом белке);

е) определение для каждой цепи последовательности аминокислот с по­ мощью ступенчатой деградации по Эдману или MS/MS-спектрометрии

(§ 8-2);

ж) восстановление структуры исходного биополимера, т. е. определение порядка расположения в исходном белке набора фрагментов с уже установ­ ленной первичной структурой.

Подходы к определению аминокислотного состава уже были рассмотре­ ны в § 7.2, а к определению концевых групп - в § 7.3. Вопрос о четвертичной структуре белков будет рассмотрен в § 9.2. Вопрос восстановления структу­ ры исходного биополимера по набору установленных фрагментов рассматри­ вается после описания методов селективного расщепления белков на фраг­ менты. Специфическое расщепление белков может быть осуществлено энзиматически или специальными химическими методами.

В живой природе существует большое число ферментов, катализирую­ щих селективный гидролиз определенных пептидных связей. Многие из них являются пищеварительными ферментами и способствуют превращению

Наряду с этим разработано несколько химических методов специфиче­ ского расщепления полипептидов. Среди них особенно широко используется бромциановый метод расщепления по остаткам метионина.

По указанному методу анализируемый полипептид обрабатывается бромцианом BrC=N, который атакует атом S остатков метионина с образованием цианосульфониевого производного. Последнее благодаря наличию положи­ тельного заряда на атоме S становится эффективным алкилирующим реаген­ том, способным атаковать соседнюю карбонильную группу с образованием иминолактона и одновременным отщеплением метилизотиоцианата. Иминолактон легко гидролизуется, что приводит к разрыву пептидной связи (рис. 60).

Метод селективного расщепления пептидных связей остатка триптофана основан на высокой реакционной способности индольного ядра. При этом благодаря низкому содержанию в белках триптофана должны образоваться несколько крупных фрагментов, удобных для секвенирования. Были предло­ жены некоторые подходы к такому расщеплению. В качестве примера ниже рассмотрен процесс, основанный на окислительном галогенировании ин­ дольного ядра остатка триптофана TV-бромсукцинимидом. Благодаря своей высокой реакционной способности он генерирует электрофильную частицу - положительно заряженный ион Вг+ На рис. 61 приведена предполагаемая схема процесса, приводящего к расщеплению пептидной связи, образованной карбоксильной группой триптофана.

Согласно этой схеме процесс начинается с электрофильного присоедине­ ния Вг+ к атому 3С индольного цикла остатка триптофана с превращением этого цикла в остаток 3-броминдоленина (1). Далее следует нуклеофильное присоединение молекулы воды и затем элиминация НВг и депротонирование ИН2+-группы, в результате чего индольный фрагмент превращается в окси-

178 Глава 8. Первичная структура пептидов и белков

Рис. 60. Расщепление полипептидов бромцианом

индольный (2). Повторное присоединение Вг+ и последующая реакция атома Вг остатка 3-бромоксиндола (3) с карбонильным кислородом остатка триптофанила приводит к циклизации с образованием фрагмента иминолактона

(4). При этом пептидная связь, образуемая остатком триптофанила, превра­ щается в легко гидролизуемую связь C=NH+, что и приводит к разрыву пеп­ тидной связи (см. рис. 61).

Рис. 61. Схема расщепления пептидной связи по остаткам триптофана. На схеме обозначены остатки: 1 - 3-броминдоленина, 2 - оксоиндола, 3 - 3-бромоксоиндола, 4 - продукт циклизации

Селективное расщепление пептидной цепи по остаткам цистеина может быть осуществлено путем цианирования SH-группы. Хорошими цианирующими реагентами являются 2-нитро-5-тиобензойная кислота и соли 1-циано- диметиламинопиридина. Остатки цистеина превращаются в остатки тиоцианоаланина, которые циклизуются с образованием фрагментов ацилиминотиазолидина, по которым проходит гидролиз с разрывом пептидной связи. Про­ цесс протекает по схеме:

Расщепление на достаточно крупные блоки осуществляют по фрагментам Asn-Gly. Такие фрагменты могут образовывать циклические структуры, по которым обычно происходит фрагментация пептидной цепи под действием гидроксиламина по схеме:

Повышенная лабильность связи Asn-Gly по сравнению со связями Asn с другими аминокислотами, вероятно, обусловлена отсутствием при цикли­ зации с глицином стерических затруднений, которые могут возникать с дру­ гими боковыми радикалами.

Установление порядка, в котором секвенированные фрагменты были рас­ положены в исходном белке, проводится с помощью подхода, известного как метод перекрывающихся блоков. Метод основан на проведении двух (в неко-