Биофизика (Присный)

повреждения ДНК). По этой же причине ослабление эффекта облучения при снижении мощности дозы выражено отчётливее в случае редкоионизирующих γ- и рентгеновского излучений и может быть значительно слабее или даже полностью отсутствовать при действии плотноионизирующих излучений, вызывающих значительно более тяжелые, невосстанавливаемые повреждения.

Эффект ослабления более характерен также для тех тканей организма, которые обладают высокой пролиферативной активностью и соответственно более высоким уровнем восстановительных (репарационных) процессов. Особенно отчетливо этот эффект наблюдается при лучевом поражении слизистой тонкой кишки.

При лучевом воздействии на ткани с низким уровнем пролиферативной активности и восстановительных процессов (например, на нервную ткань, печень, мышцы) феномен ослабления эффекта облучения при снижении мощности дозы менее выражен или даже отсутствует при воздействии любых видов ионизирующих излучений.

Наиболее важным фактором, определяющим в конечном итоге степень радиационного поражения биологического объекта, является доза облучения. Поэтому в радиобиологических экспериментах наиболее распространенным является исследование дозовой (или дозной) зависимости какого-либо радиационного эффекта, отражающего ту или иную сторону лучевого поражения организма. Наиболее четкие радиационные эффекты любых физиологических, биохимических, генетических или других параметров могут быть использованы в качестве критериев для оценки степени лучевого поражения организма.

Одним из наиболее часто применяемых критериев оценки действия излучения на биологические объекты является такой четко регистрируемый интегральный показатель как гибель организма, являющаяся конечным итогом многочисленных нарушений, происходящих при лучевом поражении.

Оценку летального действия излучения на биологические объекты проводят, исследуя зависимость гибели или выживаемости организмов от дозы облучения (т.е. от поглощенной дозы). Срок наблюдения, в течение которого обычно регистрируется гибель (или выживаемость) зависит, в частности от вида используемого объекта. При исследовании летального действия излучения на большинство видов позвоночных животных срок наблюдения составляет обычно 30 суток (однако, для некоторых видов позвоночных этот срок составляет 60 суток).

Полулетальная доза – это доза облучения, при действии которой погибает 50% облученных организмов. Эту дозу обозначают как ЛД50 или ЛД50/30 (ЛД50/60), где в знаменателе подстрочного индекса указывают срок (в сутках), в течение которого наблюдают за гибелью. Величина полулетальной дозы очень широко используется в радиобиологии.

Минимальная абсолютно летальная доза (МАЛД) – минимальная доза,

вызывающую гибель всех облученных организмов.

120

Минимальная летальная доза (МЛД) – практически та максимальная доза, которая не вызывает гибели ни одного из облученных организмов.

Строго говоря, термины «минимальная абсолютно летальная доза» и «минимальная летальная доза» не совсем правомерны. Поэтому обычно за минимальную абсолютно летальную дозу принимают дозу, вызывающую гибель 99% объектов (ЛД99), а за минимальную летальную дозу – дозу, вызы-

вающую гибель 1% объектов (ЛД1).

Дозы облучения, лежащие в диапазоне от минимальной летальной дозы до минимальной абсолютно летальной дозы, называют летальными дозами.

Дозы, превышающие минимальную абсолютно летальную дозу, опре-

деляют как сверхлетальные.

Дозы, лежащие ниже минимальной летальной дозы – как сублеталь-

ные.

Биологические факторы, определяющие радиобиологические эффекты

Величина радиобиологического эффекта (при одной и той же дозе облучения) существенно зависит от вида облучаемого биологического эффекта. Иными словами биологические объекты обладают различной радиочувствительностью.

Термин радиочувствительность широко используется в радиобиологии и означает поражаемость биологических объектов (клеток, тканей, органов или организма в целом) ионизирующим излучением. Синоним – радиопоражаемость, антоним – радиоустойчивость, или радиорезистентность.

Радиочувствительность живых организмов широко варьирует в зависимости от их видовой принадлежности. Сравнение радиочувствительности обычно проводят по величине полулетальной дозы ЛД50. Чем выше значение ЛД50, тем ниже радиочувствительность; чем ниже значение ЛД50, тем выше радиочувствительность.

Наиболее радиочувствительными являются млекопитающие, для которых полулетальные дозы варьируют для разных видов в основном от 1,5 до 15 Гр. Напротив, наиболее высокой радиоустойчивостью (радиорезистентностью) обладают простейшие, бактерии и вирусы, для которых ЛД50 может достигать нескольких тысяч грей. Таким образом, в целом по мере усложнения биологической организации радиочувствительность существенно повышается. Однако встречаются и исключения, когда среди низших филогенетических групп обнаруживаются отдельные виды, радиочувствительность которых очень высока и сравнима с таковой для млекопитающих (или даже превышает ее). В целом для низших филогенетических групп характерна значительно большая вариабельность радиочувствительности, чем для высших.

Наиболее радиоустойчивым из известных биологических объектов является бактерия Micrococcus radiodurans, обнаруженная в воде охлаждающего канала американского ядерного реактора, где мощность дозы составляла 100 тысяч Гр/сут. В таких суровых условиях эти бактерии не погибали, размно-

121

жались, в общем, прекрасно себя чувствовали, за что и получили своё название.

Следует отметить, что значительные колебания радиочувствительности могут наблюдаться даже для различных штаммов, линий, сортов одного и того же вида биологического объекта.

Приведенные данные о радиочувствительности различных биологических объектов относятся к взрослым организмам. Однако многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют, что в процессе онтогенетического развития радиочувствительность организмов может существенно изменяться. Наиболее четкие данные в этом отношении получены для насекомых, радиочувствительность которых резко снижается в ходе онтогенеза.

Четкие сведения о возрастной зависимости радиочувствительности крупных животных в литературе практически отсутствуют. В целом, однако, принято считать, что у млекопитающих взрослые половозрелые особи относительно радиоустойчивы, а молодые и стареющие животные более радиочувствительны. У новорожденных радиочувствительность может быть либо относительно высокой, либо низкой, в зависимости от видовой принадлежности животных.

Однако, наиболее чувствительным к действию ионизирующих излучений (т.е. наиболее радиопоражаемым) у млекопитающих является период внутриутробного (пренатального) развития.

На основании экстраполяции данных, полученных на животных, считают, что наиболее радиочувствительным периодом внутриутробного развития человека является интервал от оплодотворения до примерно 38-х суток (5,5 недель). Наибольшую встречаемость уродств и гибели новорожденных следует ожидать при облучении в период между 18 и 38 сутками эмбрионального развития, т.е. в период, когда интенсивно осуществляется обособление зачатков и формирование основных органов и тканей.

Эти данные, однако, не означают, что при облучении в более поздние сроки (в плодный период) не могут происходить более тонкие функциональные нарушения, индуцированные облучением.

Обследование лиц, подвергшихся облучению во время атомных бомбардировок в Японии, показало, что наиболее критическим периодом в отношении умственного развития человека (а именно, появления умственной отсталости) является период от 8 до 15 недели внутриутробного развития. Показано, что облучение в этот период внутриутробного развития даже в дозах 0,1-0,2 Гр может вызвать заметное увеличение встречаемости умственной отсталости. При облучении в период от 15 до 25 недели внутриутробного развития частота умственной отсталости была в 4 раза ниже, чем при облучении в период от 8 до 15 недели. При облучении в период до 8 недели или после 25 недели появление умственной отсталости не было отмечено.

Дозы порядка 0,1 Гр достоверно повышают также встречаемость злокачественных новообразований у лиц, подвергшихся облучению на стадии внутриутробного развития (особенно в течение последних трех месяцев внутриутробного развития).

122

Доза 0,1 Гр (10 рад) рассматривается радиологами как предельная доза для наиболее чувствительного периода внутриутробного развития (от 10 дней до 26 недель), выше которой беременным пациенткам можно рекомендовать осуществление аборта, чтобы избежать возможности рождения ребенка с заметными дефектами.

Общей закономерности относительно половых различий в радиочувствительности живых организмов не существует. Даже разные линии животных одного вида (например, мышей) могут иметь противоположные половые различия в радиочувствительности: у одних линий более радиочувствительными являются самки, у других – самцы. Но все же обычно самки более устойчивы к действию облучения. Однако обычно половые различия в радиочувствительности не превышают 10-15%.

Физиологическое состояние животных может вносить определенные изменения в степень и время проявления радиационного поражения.

Так, широко известны эксперименты, в которых при облучении животных, находящихся в состоянии естественной спячки (например, у сусликов), развитие лучевого поражения существенно замедлялось. Однако после пробуждения лучевое поражение в большинстве случаев развивалось также, как и у бодрствующих животных, т.е. выживаемость не изменялась, увеличивалось лишь время жизни животных.

Тем не менее, известны также эксперименты, в которых животные, невпадающие в естественную спячку, но находящиеся в состоянии глубокого охлаждения во время облучения, проявляли и более высокую постлучевую выживаемость по сравнению с неохлажденными во время облучения животными. Таким образом, состояние обмена веществ в организме в момент облучения может в определенной степени влиять на развитие лучевого поражения: в большинстве случаев повышение интенсивности обмена веществ в момент облучения увеличивает радиочувствительность.

Развитие лучевого поражения в некоторой степени зависит и от используемой диеты. Наличие в пище витаминов, различных микроэлементов, повышающих общую резистентность организма, увеличивает и его радиоустойчивость. В литературе имеется большое количество сообщений о благоприятном влиянии витаминов Е, А, β-каротина и других, которое проявляется в частичном предотвращении лучевых эффектов и более быстром восстановлении. Известны также эксперименты, в которых включение в состав стандартной для лабораторных животных диеты определенной растительной пищи или экстрактов некоторых растений приводило к увеличению выживаемости облучаемых животных.

В большинстве случаев для проявления благоприятного воздействия какого-либо пищевого компонента необходимо его длительное скармливание животным перед облучением – в течение не менее 1-2 недель. Защитные эффекты пищевых компонентов, однако, не велики. Эффективность благоприятного воздействия пищевых компонентов при их скармливании после облучения обычно еще ниже, чем при скармливании до облучения.

123

Лекция 16. РАДИАЦИОННАЯ БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

Дозовые зависимости гибели и выживаемости многоклеточных организмов принято изображать соответственно в координатах «% погибших организмов – доза облучения» и «% выживших организмов – доза облучения».

Вотличие от этого в клеточной радиобиологии применяют обычно только кривые выживаемости, причем построенные в полулогарифмическом масштабе, а именно с использованием логарифмической шкалы ординат.

Вобщем виде кривая выживаемости клеток в полулогарифмическом масштабе состоит из двух участков: т.н. "плеча" и линейного участка. Величина плеча зависит от 1) вида излучения и 2) типа клеток.

Типичные кривые выживаемости могут наблюдаться при облучении только редкоионизирующим излучением (рентгеновским или γ-излучении). При облучении плотноионизирующим излучением кривые выживаемости имеют слабовыраженное плечо или вовсе его не имеют (например, в случае α-облучения). Такие же кривые выживаемости, не имеющие плеча, наблюдаются и при облучении некоторых типов клеток редкоионизирующим излучением.

Количественно кривые выживаемости, не имеющие плеча, описывают-

ток, N – количество клеток, выживших (т.е. сохранивших колониеобразующую способность) после облучения в дозе D, k – коэффициент, определяющий наклон прямой (чем выше k, тем круче наклон).

В случае наличия плеча кривые выживаемости описываются уравнени-

ем: N 1 1 e kD n , где n – т.н. экстраполяционное число – значение орди-

N0

наты в месте пересечения с экстраполированным прямолинейным участком кривой выживаемости.

Наличие подобного рода зависимости выживаемости клеток от дозы облучения было продемонстрировано еще в 20-е годы ХХ столетия. Уже в то время было отмечено, что кривые выживаемости клеток после воздействия излучения отличаются от кривых выживаемости клеток после воздействия каких-либо токсических агентов химической природы, например ядов.

Кривые выживаемости клеток, получаемые при действии химических агентов, характеризуются наличием некоторой пороговой концентрации, ниже которой все клетки выживают, а после превышения которой происходит резкое снижение доли выживших. Переход от 100%-ной выживаемости до нулевой выживаемости происходит в очень узком диапазоне концентраций химического агента.

S-образную форму кривой выживаемости клеток после действия агентов химической природы объясняют обычно с т.н. «биологических» позиций, а именно исходя из наличия индивидуальных различий клеток в клеточной популяции, подвергнутой этому воздействию. Чем меньше выражены индивидуальные различия, тем круче наклон кривой выживаемости.

124

Однако, на кривых выживаемости клеток, подвергнутых облучению, отсутствует четкий порог: гибель части клеток наблюдается даже при очень низких дозах облучения, а гибель другой части клеток той же популяции – лишь при значительно более высоких дозах. Объяснение подобной формы кривой выживаемости облученных клеток с «биологических» позиций звучало в начале прошлого века весьма неубедительно, т.к. трудно было представить, что внутри генетически однородной популяции могут находиться клетки, различающиеся по устойчивости к облучению в сотни и тысячи раз. Поэтому в 20-е годы прошлого века в противовес «биологическому» подходу сформировался «физический» (или «биофизический») подход к объяснению и интерпретации кривых выживаемости клеток, подвергнутых действию ионизирующего излучения.

Воснове этого направления лежала «теория точечного тепла», разработанная Дессауэром (Dessauer) в 1922 г. Эта теория опиралась на следующие основные идеи:

- несмотря на то, что плотность поглощенной энергии в облучаемом объекте в среднем очень низкая, энергия самих актов поглощения весьма велика и поэтому в микрообъемах вещества, в которых произошли акты поглощения энергии, происходит его локальное нагревание (т.е. появление т.н. "точечного тепла"), в результате чего вещество претерпевает значительные локальные изменения, обусловленные разрывом химических связей или активацией химических реакций;

- клетка гетерогенна (т.е. неоднородна) по своему объему в отношении чувствительности к облучению и имеет как исключительно важные для жизни области, повреждение которых приводит клетку к гибели, так и области, относительно несущественные для выживания клетки;

- пространственное распределение появления "точечного тепла" внутри облученной клетки имеет случайный характер, т.е является чисто статистической (т.е. вероятностной) функцией.

Таким образом эта теория заявила, что конечный эффект в клетке (например, гибель) определяется вероятностью осуществления акта поглощения энергии (т.е. появления "точечного тепла") в жизненно важных микрообъемах (областях) клетки. При увеличении дозы облучения вероятность осуществления акта поглощения энергии в этих клеточных областях возрастает, при снижении дозы – уменьшается. Однако даже при очень высокой дозе облучения существует определенная вероятность того, что в каком-то количестве клеток не произошло актов поглощения энергии в жизненно важных клеточных областях и поэтому эти клетки останутся неповрежденными облучением. И наоборот – даже при очень низкой дозе существует вероятность того, что в части клеток произойдут акты поглощения энергии в жизненно важных клеточных областях, что вызовет гибель этих клеток.

Вдальнейших работах Дж. Кроутера (J.A. Crowther; в русскоязычной литературе встречаются также и другие варианты написания фамилии этого

исследователя – Краузер, Кроузер), Д. Ли (D.E. Lea), К. Циммера (K.G. Zimmer) и Н.В. Тимофеева-Ресовского в 20-30-е годы прошлого столе-

125

тия основные идеи теории точечного тепла получили дальнейшее развитие, в результате чего были сформулированы 2 фундаментальных положения в радиобиологии.

Первое положение, получившее название «принцип попадания», может быть сформулировано следующим образом:

Поглощение энергии в облучаемом объеме происходит в результате дискретных актов взаимодействия квантов излучения с веществом – т.н. «попаданий», пространственное распределение которых в облучаемом объекте имеет случайный характер.

Таким образом, "принцип попадания" отмечает дискретность и вероятностный (случайный) характер актов взаимодействия излучения с веществом. Фактически попаданием считается возникновение акта ионизации какихлибо молекул в облучаемом объеме.

Второе положение, получившее название «теория мишени», может быть сформулировано следующим образом:

Клетка имеет в своем составе как исключительно важные для выживания области – т.н. "мишени", радиационное повреждение которых приводит клетку к гибели, так и области, относительно несущественные для выживания клетки.

Таким образом, «теория мишени» отмечает биологическую гетерогенность различных областей (микрообъемов) внутри клетки в отношении чувствительности к облучению и наличие внутри клетки «мишеней» – чувствительных областей, радиационное повреждение которых приводит клетку к гибели.

Поражение клеточных мишеней может происходить как при одном единственном попадании в нее – это т.н. одноударные мишени, так и при нескольких попаданиях – это т.н. многоударные мишени. Более того, в клетке возможно наличие нескольких мишеней и гибель клетки может наступить лишь после того, как все они получили определенное число попаданий. В реальности анализ многомишенных кривых гибели требует слишком много допущений и исследования влияния многих параметров и поэтому в большинстве случаев оказывается очень ненадежным. Кроме того, принцип попадания и теория мишени не учитывают наличия в клетке репарационных процессов, которые существенно затрудняют интерпретацию кривых выживаемости.

Для кривой выживаемости, не имеющей плеча, важной и фактически единственной характеристикой является величина D37 – доза, при которой выживает 37% облученных клеток. Вернемся к уравнению, описывающему

кривую выживаемости, не имеющую плеча: N e kD .

N0

В этом уравнении при некоторой дозе облучения выполняется условие kD = 1. Это соответствует случаю, когда в среднем число попаданий в одноударные мишени равно числу мишеней. В действительности же при этой дозе облучения часть попаданий происходит в однажды уже пораженные ми-

126

шени, а некоторые мишени не испытали ни одного попадания. Подставив в

это уравнение значение kD = 1, получаем: N e kD e 1 0,368 0,37 .

N0

Таким образом, при дозе облучения, которая приводит к выживаемости 37% клеток, число попаданий в мишени в среднем равно числу мишеней. Поэтому дозу D37 называют также среднелетальной дозой (не путать с ЛД50).

Для кривой выживаемости, имеющей плечо, имеется несколько важных характеристик:

-во-первых, это D37 – доза, при которой выживает 37% облученных клеток;

-во-вторых, доза Dq – доза, соответствующая точке пересечения экстраполированного прямолинейного участка кривой выживаемости с осью абсцисс, проведенной на уровне 100%-ной выживаемости; Dq характеризует величину плеча;

-в-третьих, доза D0 – определяется как приращение дозы, снижающей выживаемость в е раз на прямолинейном участке кривой выживаемости; служит исходной мерой радиочувствительности;

-в-четвертых, экстраполяционное число n – значение ординаты в месте ее пересечения с экстраполированным прямолинейным участком кривой выживаемости; в теории мишени экстраполяционное число определяет какое количество попаданий в мишень необходимо для поражения этой мишени.

Внастоящее время ясно, что интерпретация кривых выживаемости клеток чисто с позиций принципа попадания и теории мишени в большинстве случаев не является корректной, так как здесь не учитываются процессы восстановления индуцированных облучением повреждений. Тем не менее, все перечисленные выше характеристики кривых выживаемости широко используются при анализе этих кривых. В частности, величину Dq используют в качестве показателя способности клетки осуществлять репарационные (восстановительные) процессы: чем больше плечо, тем выше репарационная способность клетки.

Принцип попадания и теория мишени имеют ряд очень важных практических приложений. Например, на основании их положений возможно определение размера мишени. Это возможно, если процесс инактивации клеток (или процесс инактивации какого-либо фермента при его облучении in vitro) описывается кривой, не имеющей плеча, т.е. является одноударным процессом. В этом случае массу, молекулярную массу и объем мишени можно легко рассчитать по следующим формулам:

D37 (в радах)

Рассчитанные таким образом молекулярные массы большого числа ферментов (в данном случае речь идет не об облучении клеток, а об облуче-

127

нии ферментов в водных растворах) очень хорошо совпадали с их молекулярными массами, рассчитанными другими физико-химическими методами.

Что же является основной клеточной мишенью при действии радиации? Основной мишенью в клетке является клеточное ядро, а точнее – молекулы ДНК.

Тот факт, что именно ядро является основной клеточной мишенью при действии радиации, было, в частности, показано в экспериментах по определению размеров мишени в клетке. Оказалось, что размер клеточной мишени примерно совпадает с размером клеточного ядра.

Отсюда следует один из важнейших выводов из принципа попадания и теории мишени: чем выше содержание ДНК, тем чувствительнее клетка к действию ионизирующего излучения.

Корреляция между радиочувствительностью и количеством нуклеотидов в нуклеиновой кислоте наблюдается особенно четко, если эти биологические объекты сгруппировать в 4 группы в зависимости от структурной организации их нуклеиновых кислот и проанализировать эту корреляцию внутри каждой из них. Это следующие группы: группа вирусов с одноцепочечной ДНК и РНК, группа вирусов с двуцепочечной ДНК, группа гаплоидных бактерий и дрожжей, группа диплоидных бактерий и дрожжей, а также клеток птиц и млекопитающих.

В каждой из этих групп – чем больше число нуклеотидов, тем выше радиочувствительность.

Интересно также обратить внимание, что при одном и том же числе нуклеотидов вирусы с двуцепочечной ДНК примерно на порядок более устойчивы, чем вирусы с одноцепочечной ДНК и РНК, а диплоидные клетки примерно на порядок более устойчивы, чем гаплоидные клетки. Это, в частности говорит о том, что наличие двух цепочек в молекуле ДНК и двойного набора хромосом (т.е. двух копий каждой из молекул ДНК) повышает надежность биологического объекта и его устойчивость к облучению.

Предполагают, что второй по значению мишенью в клетке являются биологические мембраны. Однако большинство исследователей всё же считают это утверждение недостаточно доказанным.

128

Лекция 17. СОБСТВЕННЫЕ ФИЗИЧЕСКИЕ ПОЛЯ ОРГАНИЗМА Виды физических полей тела человека

Вокруг человека существуют электромагнитные и акустические поля. Можно выделить основные 4 диапазона электромагнитного излучения и 3 диапазона акустического излучения, в которых ведутся исследования.

Диапазон собственного электромагнитного излучения ограничен со стороны коротких волн оптическим излучением, более коротковолновое излучение – включая рентгеновское и γ-кванты – не зарегистрировано. Со стороны длинных волн диапазон можно ограничить радиоволнами длиной около 60 см. В порядке возрастания частоты четыре диапазона электромагнитного поля включают в себя:

1)низкочастотное электрическое (Е) и магнитное (В) поле (частоты ниже 103 Гц);

2)радиоволны сверхвысоких частот (СВЧ) (частоты 109-1010 Гц и длина волны вне тела 3-60 см);

3)инфракрасное (ИК) излучение (частота 1014 Гц, длина волны 3-10

мкм);

4)оптическое излучение (частота 1015 Гц, длина волны порядка 0,5

мкм).

Источники электромагнитных полей разные в различных диапазонах частот. Низкочастотные поля создаются главным образом при протекании физиологических процессов, сопровождающихся электрической активностью органов: кишечником (~1 мин), сердцем (характерное время процессов порядка 1 с), мозгом (~0,1 с), нервными волокнами (10 мс). Спектр частот, соответствующих этим процессам, ограничен сверху значениями, не превосходящими ~1кГц.

В СВЧ и ИК-диапазонах источником физических полей является тепловое электромагнитное излучение.

Чтобы оценить интенсивность электромагнитного излучения на разных длинах волн, тело человека, как излучатель, можно с достаточной точностью моделировать абсолютно черным телом, которое, как известно, поглощает все падающее на него излучение и поэтому обладает максимальной излучающей способностью.

Излучательная способность тела – количество энергии, испускаемой

единицей поверхности тела в единицу времени в единичном интервале длин волн по всем направлениям – зависит от длины волны и абсолютной температуры тела.

Измерение теплового излучения позволяет определить температуру тела человека из-за того, что спектральная зависимость теплового излучения меняется с ростом температуры.

Диапазон собственного акустического излучения ограничен со стороны длинных волн механическими колебаниями поверхности тела человека (0,01 Гц), со стороны коротких волн ультразвуковым излучением, в частности, от тела человека регистрировали сигналы с частотой порядка 10 МГц. В порядке возрастания частоты три диапазона акустического поля включают в себя:

129