ТОХФ / 6 группа (ХТБМП) / Биохимия / Лекции - Коваленко - 2003 / 1. введение

17

Я состою из действующей силы и телесной материи. Ни одно из них не обращается в ничто, так как они не возникают из ничего. Каждая часть моего существа через превращение входит в какую-нибудь часть мира и эта в свою очередь опять в другую часть его, и так бесконечно совершаются его превращения. В силу по-добных превращений возник и я, как и мои родители, и так назад до бесконечности.

Марк Аврелий Антонин, 121-180 гг.

ВВЕДЕНИЕ

Биохимия, или химия живого, представляет собой самостоятельную естественно-научную дисциплину, которая все чаще и чаще включается в учебные планы не только для подготовки специалистов в области молекулярной биологии или других биологи-ческих наук, но и для подготовки химиков самых разных направлений, поскольку любые их разработки так или иначе будут контактировать с живой природой. При этом понятно, что освоение всего материала, накопленного за многие годы развития этой области естествознания, даже для специалистов в области химии и технологии биоло-гически активных веществ не представляется возможным. Задача предлагаемого курса состоит в том, чтобы в рамках целостного курса биохимии создать основы для пони-мания механизмов действия и биотрансформации лекарственных средств, агрохими-ческих препаратов и других ксенобиотиков, тем более, что в классификации биологи-чески активных веществ давно уже используются не химические принципы, а меха-низмы биологической активности.

В одном из номеров журнала «Химия и жизнь» было предложено оценить возможность проявления токсических свойств у ряда химических соединений, представленных толь-ко их химическими формулами. Хорошо зная неорганическую химию можно было на основании различия в химических свойствах тетрафторида и гексафторида серы пред-положить безвредность второго и высокую токсичность первого, но думаю, что ни один читатель этого журнала, даже из тех, кто подробно изучил обычные учебники по биохимии, не сможет правильно оценить токсичность 2,3,4,6-тетрахлордибенздиок-сина, если, конечно, он не занимался этой проблемой специально.

Курс биохимии, который предстоит освоить тем, кто решил специализироваться в области синтеза и изучения биологически активных веществ, должен решить две основ-ные задачи – дать полное представление об этой области естественных наук и заложить основы, требуемые для освоения материала, излагаемого в курсе медицинской химии (Midicinal chemistry), токсикологии, химии агрохимических препаратов и молекулярной патофизиологии (Medical chemistry). В 1997 году Комиссия ИЮПАК дало такое опре-деление медицинской химии: «Медицинская химия является химической дисциплиной, включающей также аспекты биологии, медицины и фармацевтики. Она заключается в изобретении, открытии, дизайне, идентификации и получении биологически активных веществ, в изучении их метаболизма, в интерпретации их механизма действия на моле-кулярном уровне, а также в установлении взаимосвязей структура-активность». Из этого определения следует, что медицинская химия представляет собой область знаний на границе органической химии с биохимией.

Возможны два подхода к проблеме поиска биологически активных веществ и изучения отклика объектов живой природы на химические соединения естественного или искусственного происхождения - статистический и биорациональный. Первый из них представлен накоплением информации о биологической активности в отдельных классах органических соединений и предсказанием свойств новых веществ на основа-нии анализа зависимости структура-активность для известных соединений. Для этого в определенном классе веществ синтезируют нескольких десятков структурных аналогов и проводят детальное изучение различных аспектов их биологической активности и физико-химических характеристик. После этого полученные соединения разбиваются на две группы, составляющие обучающую и проверяющую матрицы. Основная задача состоит в том, чтобы представить строение молекулы и ее свойства в виде числовых характеристик – дескрипторов. После этого на соединениях, входящих в обучающую матрицу, составляется математическое описание зависимости структура-активность, валидность которого проверяется на второй контрольной группе соединений (10-20 % от базы данных). Если математическое описание верно (валидно), то его можно исполь-зовать для предсказания свойств соединений на основании их структурных формул.

Первые закономерности, соответствующие современным представлениям о коли-чественных зависимостях биологической активности от строения (QSAR - Quantitative Structure-Activity Relationship) были получены еще в 1863 году, когда французский исследователь Крос показал, что токсичность простейших алифатических спиртов воз-растает до определенного максимального значения по мере уменьшения их раство-римостей в воде. В тридцатые годы нашего столетия Л.П.Гаммет предложил известное уравнение, которое связывает электронные свойства ароматических соединений с их реакционной способностью, и разработал концепцию линейных зависимостей свобод-ных энергий, с помощью которых химические свойства веществ могут быть представ-лены аддитивными комбинациями корреляционных факторов. Следующим этапом в развитии техники QSAR стали стерические параметры Тафта, распространившего идеи Гаммета на алифатические соединения. Но основоположником современной техники QSAR стал калифорниец Ханш (Ганч, Hansch), дополнивший электронные параметры Гаммета и стерические параметры Тафта характеристиками растворимости веществ в полярных и неполярных средах, поскольку ведь это ключевой вопрос транспорта ве-ществ в многоклеточных органимах.

Сейчас в уравнениях QSAR используются топологические дескрипторы, описывающие связанность атомов в молекуле, ее разветвленность, коэффициент распределения в сис-теме октанол-вода (показатель гидрофильно-липофильного баланса), электронные дескрипторы, включающие константы Гаммета, дипольные моменты, молекулярные рефракции, потенциалы ионизации, а также стерические эффекты, константы Тафта, радиусы Ван-дер-Ваальса, общую поверхность молекулы и т.д. Несмотря на то, что сам Ханш оценивает современное состояние техники QSAR очень критично ("Мне кажется, что даже начало еще не положено"), этот подход уже широко используется на практи-ке. Особенность статистического подхода к проблеме биологической активности состо-ит в том, что при этом живая система остается "черным ящиком" – молекулярные меха-низмы взаимодействия биохимических систем с изучаемым классом соединений в этом случае не рассматриваются. При всех достоинствах техники QSAR ее недостатки оче-видны: такой подход к оценке биологической активности применим только для соеди-нений, входящих в большой ряд тщательно изученных и охарактеризованных по мно-гим параметрам (число дескрипторов может быть более тысячи) структурных аналогов. В таких рядах с помощью QSAR можно не синтезируя соединение по его химической формуле определить токсичность, выбрать структуру, которая обеспечит максималь-ную фотостабильность, или получить другую аналогичную информацию о свойствах. У известных соединений можно выявить структурные элементы, отвечающие за тот или иной вид биологической активности. И все же поиск новых классов биологически ак-тивных веществ с помощью техники QSAR пока невозможен, поскольку статистичес-кие методы анализа, соединяющие экспериментальные химические и биологические параметры, анализируют оптимальные структуры только в определенной узкой группе близких по строению соединений. В будущем, когда удастся преодолеть ограничен-ность современных приемов QSAR, области применения этой методологии, конечно, расширятся.

Чисто химический подход к синтезу новых биологически активных соединений сейчас стал малопродуктивным, хотя современные методологии комбинаторного синтеза зна-чительно расширили возможности получения большого числа микроколичеств новых веществ, направляемых на выявление у них биологической активности. Если в начале пятидесятых годов до практического использования доводилось одно из 8-10 тысяч полученных новых соединений, то сейчас ужесточение требований к эффективности и безопасности снизило этот показатель продуктивности до 80-100 тысяч.

Это тем более удивительно, что наработанный за многие десятилетия эксперименталь-ный материал позволяет более разумно подходить к поиску новых биологически актив-ных веществ, особенно, если при этом есть четкие представления о протекании метабо-лических и регуляторных процессов в живых организмах. При поиске новых лекарств или агрохимических препаратов, при обнаружении биологической активности у какого-либо соединения методология биорационального подхода предполагает использование ряда приемов для поиска его новых аналогов, среди них можно выделить:

• Вариация заместителей

• Увеличение/уменьшение размеров молекулы

• Увеличение/уменьшение размеров цепочек в структуре ФАВ

• Увеличение/уменьшение размеров циклов в структуре ФАВ

• Вариация циклов

• Использование (био)изостерного замещения

• Упрощение структуры ФАВ или «вычленение» ее фрагментов

• Усложнение структуры путем «сшивки» двух различных ФАВ или их фрагментов

• Уменьшение подвижности в молекуле ФАВ (rigidification)

• Увеличение подвижности структурных элементов ФАВ

При поиске новых классов лекарственных средств и агрохимических препаратов мно-гие научные центры проводят дорогостоящие синтетические и биологические исследо-вания, отдача от которых может быть повышена только за счет эффективного взаимо-действия синтетиков с биологами на основе точных представлений о механизмах функ-ционирования живых систем, о путях воздействия на протекание ферментативных реакций, а также на регуляцию интенсивности метаболических процессов и функцио-нирования нервной системы.

До 40 % кандидатов на роль лекарств отбраковываются на основании плохих фармако-кинетических характеристик, то есть эти соединения не проходят по таким показате-лям, как абсорбция, распределение в тканях организма, метаболические превращения или выведение их из организма (ADME – Absorbtion, Distribution, Metabolism, Excretion). Еще около 11 % оказываются токсичными в опытах на животных. Однако самые большие проблемы представляют вещества, у которых выявляется гепатоток-сичность уже после их выпуска на рынок лекарственных средств. Не менее катастро-фична и ошибка при отбраковке малоперспективных препаратов, поскольку это может свести на нет многолетний труд больших исследовательских коллективов.

Разработка лекарства занимает около 15 лет:

• В первые шесть лет основная работа выполняется синтетиками, которые за это время синтезируют около 5000 соединений с определенным видом биологической активности. Параллельно с синтезом идет предварительное тестирование (скри-нинг) соединений на животных с определением острой и хронической токсичнос-ти. Уже на этом этапе начинается и разработка лекарственных форм для наиболее вероятных претендентов на роль будущего лекарства.

• В течение еще около 2 лет проводятся клинические испытания примерно 5 соеди-нений, выявленных в первичном скрининге. Это – первая фаза фармакологичес-ких исследований. В ней принимают участие от 20 до 100 здоровых доброволь-цев, испытывающих на себе дозировку и безопасность лекарств.

• Вторая фаза длится также около 2 лет, она состоит в изучении эффективности лекарственных средств и возможных побочных эффектов уже на больных. Здесь тоже участвуют только добровольцы. Число таких пациентов колеблется в преде-лах от 100 до 500 человек.

• Третья фаза состоит в подтверждении эффективности и в определении противо-показаний в длительных экспериментах на добровольно участвующих в этом па-циентах (их число составляет от 1000 до 5000), ее продолжительность около 3 лет.

• После этого всего лишь одно соединение поступает на государственную регистра-цию. Это занимает еще около 1 года.

В США расходы на внедрение нового лекарственного средства оценивались в 2004 году в 1300-1500 млн. долларов.

Требования к лекарственным препаратам сложились давно и появление новых медика-ментозных средств направлено главным образом на расширение возможностей воздей-ствия на болезненные состояния или на усовершенствование известных лекарств с целью снятия побочных эффектов или пролонгации их действия. В соответствии с этим ассортимент фармакологических препаратов постоянно растет. Иная картина наблюда-ется в производстве химических средств защиты растений, без которых уже нельзя представить себе современное высокопродуктивное сельское хозяйство, основанное на специализации отдельных предприятий агропромышленного комплекса на выращива-ние ограниченного числа культур. Эксперимент глобального масштаба, проводившийся с широчайшим внедрением самых разных агрохимических препаратов (пестицидов), применявшихся иногда с огромными нормами расхода, сегодня можно считать закон-ченным. Постоянно ужесточающиеся требования по экологической безопасности и по-явление резистентных рас вредителей сельскохозяйственных культур стимулируют раз-работку новых препаратов, но эти же факторы приводят и к постоянному снижению ассортимента используемых на практике средств воздействия на живую природу. Если в январе 1987 года во всем мире использовалось 308 действующих начал в 1695 препаративных формах, то уже через три года осталось лишь 216 действующих начал и 958 препаративных форм. Сейчас 11 активных веществ покрывают в США около 80 % рынка химических средств защиты растений.

В рамках совершенствования биорационального подхода к синтезу новых БАВ боль-шое внимание уделяется изучению механизмов взаимодействия природных и синтети-ческих соединений с биологическими мишенями, а также исследованию путей транс-формации ксенобиотиков в живой природе. В восьмидесятые годы на базе бурного развития рентгеноструктурного анализа, вычислительной техники и компьютерной графики в исследовательских центрах стали использовать методику компьютерного молекулярного моделирования (CAMM, Computer Assisted Molecular Modeling), кото-рую по праву можно отнести к самым современным методам изучения и конструиро-вания биоактивных соединений. С помощью техники CAMM постоянно совершенст-вующиеся программы, основанные на точном знании строения рецепторных участков и активных центров биомолекул, позволяют проводить проверку гипотетических струк-тур на совместимость с белками-мишенями. Только биорациональный подход, допол-няемый техникой CAMM, позволяет принципиально модифицировать первоначальные структуры с интересными видами биологической активности, значительно сокращая усилия по синтезу и многофакторным биологическим испытаниям новых соединений.

Изучаемые биохимией механизмы функционирования клеток на молекулярном уровне уже послужили отправной точкой при поиске новых средств воздействия на живую природу и возможности использования синтетиками представляемых биохимией зна-ний неисчерпаемы.

Что же является объектом изучения биохимии, история которой насчитывает уже более 100 лет? Традиционно изучение химии живого (термин "биохимия" используется с 1903 года) начинается с простейших структурных элементов биомолекул - углеводов, аминокислот, простейших липидов. Большой вклад в эту область биохимии внес не-мецкий исследователь Э.Фишер классическими работами по химии сахаров. Им были также разработаны способы выделения аминокислот из продуктов гидролиза белков. Работы по поиску новых простых биомолекул продолжаются до сих пор, и в ходе изучения обмена веществ (метаболизма) и его регуляции постоянно открывают новые природные соединения, которые могут лечь в основу направленного синтеза новых биологически активных веществ. Многие регуляторные природные соединения и про-дукты метаболизма встречаются в самых разных видах живого, то есть существует качественное сходство живого на клеточном уровне, но на количественном уровне расхождения обязательны.

Следующий важнейший вопрос биохимии – как построены макромолекулы живого? В опытах по изучению состава живых клеток первые биохимики наталкивались на высо-комолекулярные вещества: полисахариды, белки, нуклеиновые кислоты, сложные липиды. Их качественный состав был установлен достаточно быстро, и казалось, что последовательность соединения сотен аминокислотных составляющих в белковых молекулах или тысяч нуклеозидов в нуклеиновых кислотах не удастся установить никогда. Однако современные методы выделения и анализа макромолекул биологичес-кого происхождения позволили определить не только первичное строение, но и про-странственное расположение свернутых в компактные образования линейных структур.

В 1800 году Французская академия предлагала премию в 1 кг золота тому, кто сможет вразумительно ответить на вопрос о различии между ферментом и субстратом. Еще в прошлом веке считалось, что дрожжи (первый объект биохимии) представляют собой неживые образования, а сама биохимия начиналась с работ по сбраживанию глюкозы бесклеточными гомолизатами дрожжей. Отсюда и появился термин энзим (от гр. en zimes - в дрожжах), используемый иногда для обозначения фермента, действующего вне клетки. Сейчас биокатализаторы чаще всего называют ферментами, не делая раз-личия между их функционированием в клетке или вне ее. Ответ на вопрос о принципах функционирования этих избирательных и эффективных катализаторов имеет перво-степенное значение не только для биохимии, но и для теории и практики органической химии.

Что требуется для существования живого организма? На этот вопрос уже можно от-ветить достаточно однозначно и на уровне всего организма, и на уровне отдельной клетки. Нарушения обмена веществ, связанные с отсутствием незаменимых компонен-тов пищи, легли в основу расшифровки основных метаболических путей.

Что обеспечивает превращение молекул в необходимые клеткам организма вещества? Растения поглощают только воду, минеральные соли и диоксид углерода, синтезируя из них огромное богатство органических соединений. Взрослый человек ежедневно потребляет около 400 г пищевых продуктов, их состав день ото дня меняется, но в норме тело человека сохраняет постоянный состав и вес.

Как потенциальная энергия поступающих с пищей веществ используется живыми орга-низмами? Тепловые машины работают на разнице температур, тогда как живые клетки изотермичны. И в то же время потенциальная энергия, заключенная в пище, утилизи-руется живыми организмами гораздо эффективнее, чем в тепловых машинах, а исполь-зование энергии света для синтеза всего разнообразия веществ, участвующих в разви-тии растений, вообще не имеет аналогий в неживой природе. В живых клетках все энергетические процессы так или иначе протекают через аденозинтрифосфат АТФ (ATP) – универсальный источник свободной химической энергии, используемый для генерирования тепла, совершения механической и химической работы, создания гради-ентов концентраций и для других энергозатратных процессов.

Важнейший объект изучения биохимии - синхронизация биохимических превращений. Клетки нуждаются в определенных количествах аденозинтрифосфата и строительных блоков и их всегда ровно столько, сколько требуется. Регуляция обменных процессов и ее принципы – это одна из основ биохимии. На уровне больших организмов объектом изучения биохимии становится и согласованная работа различных органов, управля-емых нервной системой, гормонами и цитокинами (нейрогуморальная регуляция).

И, наконец, проблемы взаимодействия биомолекул с ксенобиотиками, необратимая и обратимая блокировка ферментов и рецепторных белков, превращения ксенобиотиков под действием оксигеназ, редуктаз и гидролаз, реакции конъюгации и выведение из организма растворимых в воде продуктов превращения ксенобиотиков.

Еще до формирования биохимии как самостоятельной науки произошло разделение химии на органическую и неорганическую. Некоторое время существовала теория “жизненной силы”, сторонники которой считали, что синтез органических соединений из неорганических может проходить только с участием живых организмов, а уделом химиков остается лишь изучение превращений органических веществ, выделенных из живой природы. Несостоятельность виталистов достаточно быстро была показана в многочисленных экспериментах, но углубление философского спора о происхождении органической материи и живой природы имеет принципиальное значение. Ограни-ченный фактический материал по клеточному строению живых организмов и глубокий анализ данных палеонтологии позволили Дарвину сформулировать концепцию непре-рывной биологической эволюции. После этого осталось решить основной вопрос о возникновении простейших форм жизни.

Первичный состав земной атмосферы и климатические условия могут быть смоделиро-ваны на основе данных, полученных при изучении других планет Солнечной системы и космогонических теорий. Воздействия жесткого излучения, искровых и тлеющих раз-рядов на искусственные смеси воды, метана, аммиака и водорода, а именно такой и представляется первичная атмосфера Земли, приводят к образованию широкого спект-ра органических соединений, среди которых есть аминокислоты, углеводы и другие вещества, являющиеся простейшими строительными элементами живой природы.

Вот примеры химизма таких превращений: из метана и воды или из метана и аммиака при энергетическом воздействии образуются формальдегид и циановодород

Аммиак, синильная кислота и формальдегид реагируют по реакции Штрекера с образо-ванием аминоацетонитрила:

Аминоацетонитрил – это нитрил простейшей аминокислоты глицина. Его гидролиз приводит к образованию глицина, а в аналогичных превращениях других альдегидов могут быть получены и более сложные по строению аминокислоты (например, это цепочка: этан – ацетальдегид – аланин). Интересно, что уже на основе аминонитрилов могут быть получены и пептиды: аминогруппы реагируют с нитрильными функциями с образованием амидинов, которые гидролизуются в мягких условиях до амидов (пеп-тидов):

При конденсации с формальдегидом производные глицина в пептидных цепях могут быть преобразованы в производные другой аминокислоты - серина:

Важнейшим структурным элементом нуклеиновых кислот и многих ферментных сис-тем является гетероциклическое соединение 6-аминопурин или аденин, который также может быть получен в абиотических условиях. В газовой фазе циановодород тримери-зуется в динитрил аминомалоновой кислоты:

Синильная кислота реагирует с аммиаком с образованием формамидина:

Точно также реагируют с аммиаком и нитрильные группы тримера циановодорода:

Образующийся при этом диамидин аминомалоновой кислоты реагирует с двумя моле-кулами формамидина с образованием аденина:

В запаянной ампуле из синильной кислоты и аммиака аденин образуется с выходом около 40 %. Возможны, конечно, и другие пути образования аденина из синильной кислоты и аммиака.

Синтез пептидов и белков в живых клетках протекает на рибосомах, а последователь-ность аминокислот в них определяется матрицами из рибонуклеиновых кислот, но при зарождении жизни происходил, вероятно, и обратный процесс, при котором белки служили матрицей для сборки цепочек рибонуклеиновых кислот, то есть белки таким образом записывали программу своей сборки, но не исключен и другой вариант, по которому первичными были матрицы, причем не обязательно это были нынешние ДНК и РНК, ведь на молекулярном уровне также шло усовершенствование структур первич-ного живого материала.

Не очень сложно объяснить почему компоненты биомолекул в природе присутствуют только в одной стереомерной форме: биомолекулы и так слишком сложны и протекаю-щие с их участием процессы высоко специфичны. На молекулярном уровне взаимо-действие субстратов с биокатализаторами – ферментами – не может идти одинаково с различными стереоизомерами из-за сложной пространственной конфигурации актив-ного центра фермента. Гораздо сложнее объяснить то, что все двадцать аминокислот, из которых построены белки, имеют L-конфигурацию. Для объяснения этого феномена привлекались самые разные предположения, например, катализ поликонденсации ами-нокислот такими оптически активными неорганическими материалами, как кристаллы кварца. В то же время не исключено, что в условиях нашей Вселенной L-изомеры ами-нокислот вообще более устойчивы. Так, например, в рацемической аминокислоте тиро-зине в присутствии радиоактивного стронция более интенсивно идет радиолиз D‑изо-мера и постепенно накапливается L-форма.

Одним из признаков жизни является способность живых систем осуществлять обмен веществами и энергией (метаболизм) с окружающей средой. Предполагается, что поли-пептидные молекулы и нуклеиновые кислоты самоорганизовались в первые простей-шие клеточные образования, правда, вопрос о природе соединений, которые эти клетки могли использовать для построения клеточных мембран с избирательной проницае-мостью для обмена веществами и энергией с окружающей средой, пока даже не ста-вится. Любые химические структуры изменчивы, и для сохранения жизни каждая клет-ка должна воспроизвести себе подобную до того, как накопление таких случайных изменений сделает ее неспособной к воспроизводству.

Первые живые клетки использовали накопленные в природе за пребиотический период органические вещества для воспроизводства себе подобных структур и их совершенст-вования, а это уже второй признак живого. То есть уже на этом уровне шел процесс эволюции одноклеточных организмов, их специализация и усложнение. Изменчивость также обязательный признак живого, так как именно благодаря ей опасные изменения в окружающей среде не обязательно приводят к гибели всех копий начальной клетки, какие-то, отличные от исходной могут сохраниться. Очевидно, еще до исчерпания в природе абиотических органических веществ появились микроорганизмы, использовав-шие в своей жизнедеятельности энергию солнечного света, и микроорганизмы хищни-ки, которые не довольствовались разбавленными растворами остатков органических веществ, а активно поглощали другие клетки. После полного исчерпания внеклеточных органических веществ в природе некоторые использовавшие свет бактерии приспосо-бились к синтезу углеводов за счет энергии света из диоксида углерода и воды. Этот процесс сопровождается выделением кислорода, который другие клетки включали в свой метаболизм для более эффективного использования заложенной в органических соединениях энергии.

Главной особенностью живого можно считать не просто изменчивость живых систем, а их усложнение и самосовершенствование. Многоклеточные организмы развиваются из одной клетки в невероятные с точки зрения неживой природы образования с огромным числом клеток, в которых лишь на молекулярном уровне можно найти идентичные исходной клетке структуры. Клетки растений используют энергию света для получения восстановительного потенциала и носителя свободной химической энергии аденозин-трифосфата, с помощью которых образуется все многообразие органических молекул не только в растениях, но и в животных, так или иначе использующих заложенную в АТФ и в восстановительном потенциале отрицательную энтропию для своего сущест-вования. В своей книге «Что такое жизнь с точки зрения физика» Э.Шредингер сравнил энтропийные процессы в живых системах с часами. Они получают отрицатель-ную энтропию с заводом пружины, а живые системы – из света или в виде высоко-организованной материи, полученной с помощью света. И все же сложность и орга-низация жизни не может не восхищать не только на макроуровне, но и на наноуровне. В качестве примера можно привести образование АТФ из аденозиндифосфата и фос-фата в результате транспорта протонов через многокомпонентную белковую систему – АТФ-синтетазу, которая, как оказалось, работает по аналогии с турбиной и генерато-ром гидроэлектростанции и по аналогии с ней этот процесс обратим: избыток АТФ мо-жет быть использован АТФ-синтетазой для транспорта протонов против градиента их концентрации.