Лекция 5. Биология

Лекция 5. МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ХРОМОСОМНОГО НАБОРА ЧЕЛОВЕКА.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ХРОМОСОМ И ИХ ИДЕНТИФИКАЦИЯ.

Первые хромосомные препараты приготовил немецкий ученый Флемминг из роговицы глаза умершего человека. Одновременно другой немецкий ученый Гертвиг изготовил препараты из семенников человека. Когда было подсчитано число хромосом, то они насчитали 26-30 хроматидных тел. Они готовили препараты гистологическим методом, т.е. ткань человека через проводку, спирты разной концентрации и спирт + парафин заключали в твердые парафиновые блоки. А затем резали на микротоме толщиной в несколько микрон. Но поскольку крупные хромосомы достигают размеров около 10 микрон, то неминуемо некоторые хромосомы разрезались. Кроме того, хромосомы плотно лежали друг около друга, и отделить их было очень сложно. В 30е гг. прошлого века самой мощной цитогенетической школой была российская, и наши ученые (Навашин, Андрес, Живаго) так же попытались изготовить хромосомы человека. Подсчитав число хромосом, пришли к выводу, что их 48. Методика была несовершенна, но было уже известно, что у человекообразных обезьян 48 хромосом.

1879 г. - Арнольд впервые визуализировал хромосомы.

Впервые в 1956 г. два шведских ученых Тио и Леван применили новую оригинальную методику. Они в исследовании взяли эмбриональную ткань плода человека. Механически измельчив ее, они с помощью фермента трипсина, который растворяет межклеточные взаимодействия, получили взвесь отдельных клеток. Они помещают эти клетки в питательную среду, состоящую из 199 компонентов - это все известные аминокислоты, нуклеотиды, витамины, соли и, кроме того, добавлялась сыворотка крови плода человека. В этом бульоне клетки начали размножаться. Первое деление было примерно через 1 сутки. Чтобы остановить митозы они добавили колхицин (алкалоид), который растворял нити веретена деления, и хроматиды хромосом не могли в анафазе отходить к разным полюсам. Хромосомы оставались двухроматидными, т. е. все фиксировалось на стадии метафазы. Далее, для того, чтобы хромосомы отошли друг от друга из клубка, они использовали гипотонический раствор солей. Клетки набухали. Хромосомы отходили друг от друга. Затем добавлялся фиксатор, который закреплял это состояние (фиксатор Карнуа, состоящий из абсолютного спирта и ледяной уксусной кислоты). Клетки наполнялись спиртом. Затем их охлаждали, помещали на предметное стекло каплю и поджигали. Набухшие клетки лопались, взрывались, хромосомы разбрасывались и приваривались к предметному стеклу. После окраски основными красителями Тио и Леван доказывают, что у человека 46 хромосом, их отлично видно, размеры от 10 до 2 микрон, они морфологически отличаются друг от друга - есть метацентрические хромосомы (центромера посередине), есть акроцентрические (в крайнем верхнем положении) и субметацентрические. Эта методика стала очень быстро распространяться, но возникла необходимость создания номенклатуры хромосом человека (кариотипа).

Понятие кариотипа ввел Левицкий, под ним он понимал упорядоченный набор хромосом в связи с:

1) гомологичностью хромосом (одна от матери, другая от отца);

2) морфологическими особенностями (мета-, субмета-, акроцентрические хромосомы);

3) размерами;

4) положением центромеры.

В 1961 г. в Денвере, США, собирается первая конференция по хромосомам человека, где ученые, занимающиеся изучением хромосом, привели первую денверскую классификацию хромосом человека. Согласно этой классификации, каждая хромосома получила свой номер. Были выделены отдельно половые хромосомы человека (хх (ж) и ху (м)). Крупные хромосомы - в начале классификации, мелкие - в конце. Но англ. ученый Патау подверг критике эту классификацию, он пришел к выводу, что некоторые хромосомы по обычным морфологическим критериям неотличимы друг от друга, и поэтому в 1963 году на лондонской конференции было принято решение разделять хромосомы по группам. Всего было выделено 5 групп.

Группа хромосомы	Номер хромосомы	Длина в микронах	Центромерный индекс (отношение короткого плеча к длине всей хромосомы, %)
А	1	8,4	48,4
	2	8,0	39,2
В	3	6,8	46,9
	4	6,3	29,1
	5	6,1	29,3
С	6	5,9	39,1
	7	5,4	39,1
	Х	5,1	40,1
	8	4,9	34,1
	9	4,8	35,4
	10	4,6	33,9
	11	4,6	40,1
	12	4,7	30,2
D	13	3,7	17,1
	14	3,6	18,7
	15	3,5	20,3
E	16	3,4	41,3
	17	3,3	33,
	18	2,	30,9
F	19	2,7	46,5
	20	2,6	45,5
G	21	1,9	30,9
	22	1,0	30,5
	Y	1,2	27,2

В кариотипе человека к крупным хромосомам относят 1 и 3; 16 – средняя; 19,20 - мелкие. К акроцентрическим хромосомам относятся D-группа 13,14,15, средние по размерам, имеют спутники (на коротких плечах особые образования, в которых находятся гены рРНК). Здесь формируется 18s-РНК и 28s-РНК, которые строго необходимы в транскрипции и трансляции белка, поэтому эти хромосомы ориентированы спутниками друг на друга и находятся близко. К ним относят 21,22. Остальные хромосомы субметацентрические разных размеров.

Дальнейшие исследования хромосом показали, что необходимы дополнительные критерии, чтобы было возможно идентифицировать все хромосомы, усилия ученых были направлены на выявление гетерохроматиновых участков хромосом. Оказалось, что хромосомы по своей длине имеют функционально активные и неактивные участки. Неактивные участки плотно упаковываются, они окрашиваются интенсивнее основными красителями. Здесь гены не работают, а светлые участки - эухроматинове зоны, где активно функционируют гены. Кроме того, оказалось, что по концентрации А-Т, Г-Ц разные районы хромосом отличаются, а между А и Т две связи, которые легко рвутся. Таким действием обладают флуоресцентные красители, они могут разорвать связи между А и Т и встроиться между ними, это явление называется интраколяция.

В 1970 г. шведский ученый Касперсон использовал акрихин-иприт (Q-метод окраски). Зона, где много А-Т поглощала много красителя, и при облучении ультрафиолетом эти места светились, четко видна была исчерченность. Недостаток - быстрое обесцвечивание.

Группа японских ученых предложила другой метод: они обрабатывали хромосомные пластинки трипсином, который разрушал белковую часть хромосом, а после это окрашивали красителем Гимзе (эозин красный и азур-2 синий). Наблюдалось окрашивание полосками, которые стали называть бендами, и в зависимости от того, на какой стадии мы анализируем клетку, количество бендов в хромосоме может изменяться: чем ближе к профазе, тем больше бендов (например, первая хромосома - до 850 бендов), а чем ближе к анафазе, тем меньше бендов (около 200). Анализируют профатические хромосомы.

В 1971 г в Париже состоялась конференция по хромосомам, где принимается номенклатура, согласно которой все хромосомы человека были идентифицированы по 3 критериям :

1. длина,

2. центромерный индекс ,

3. расположение бендов в хромосоме.

Существовало направление евгеники – ставившая целью улучшение человеческой "породы". 30е гг XX в. стерилизация людей с "плохой наследственностью". Лисенковщина (направление возглавил Лисенков).

Пинкел и Каллиониэме обнаружили, что хромосомы по некоторым районам ДНК отличаются, изготовили зонды для каждой хромосомы, к которым они прикрепили разноцветные красители, после обработки на компьютере было видно, что хромосомы отличаются.

А-группа хромосом 1-3 метацентрические самые большие, В-группа 4,5 субметацентрические, крупные, но верхние плечи короче, чем у вторых хромосом. С-группа с 6 по 12 средние субметацентрики. D-группа акроцентрики средние со спутниками, Е-группа 19,18 маленькие, 16 метацентрик, 17,18 субметацентрические, F-группа очень маленькие метацентрики, G-группа маленькие акроцентрики со спутниками, а Y-хромосома - маленький акроцентрик без спутников.

Основные окраски:

1) Q-способ

2) G-способ с помощью Гимза и трипсином

3) окрашивается гетерохроматин в основном возле центромеры

Гетерохроматин - плотный компактный район хромосомы, обычно расположен в области центромеры, в у-хромосоме есть, но это конститутивный (постоянный) гетерохроматин. Существует факультативный гетерохроматин в одной из х-хромосом, выглядит как тельце Барра, черное пятно на ядерной оболочка. Англ. ученая Лайон объяснила это так: поскольку у женщин генетического материала в клетке больше, чем у мужчин, поскольку х-хромосома больше, то обе х-хромосомы функционируют только до закладки пола, дальше одна из них инактивируется, причем, если одна из х-хромосом несет аномальный ген, то часть клеток будет нормальной, а часть патологическими. Мозаичность. Компенсаторная часть.

При дифференциальной окраске введены обозначения. Первая цифра - номер хромосомы; потом р-короткое плечо; q - длинное плечо; третий символ - цифра номер района, в который входит данный бенд; номер бенда.

Концевые участки хромосом называются теломеры, они содержат специализированные последовательности в виде ТТА ГГГ много раз повторяющиеся, их функция очень важна. С одной стороны они защищают от прикрепления хромосом друг к другу, а с другой они определяют нашу продолжительность жизни. В 70 гг. американский ученый Хакель обнаружил, что когда культивируешь в питательной среде эмбриональную ткань человека, то как бы ты не старался, больше 60 делений не выйдет, причем от эмбриона в ср 50 делений, от 18 - 20-25 делений, с возрастом уменьшается.

Вся жизнь человека - около 50 делений (короткожитель), 60 - долгожитель. Однако было непонятно, с чем это связано. Еще в 1971 Оломников впервые высказал мнение, что все дело в теломерах. Гипотеза, что при каждом делении отрезается участок теломеры пока деление не прекращается, но доказать это не смог он. Это доказали американские ученые Блэкбер, Грейде, Шостен, они установили, что отрезается примерно 10 нуклеотидов. В теломере порядка 500. В 2009 они получили Нобелевскую премию.

Ядрышкообразующие районы красят азотокислым серебром, они локализованы в 13,14,15,21,22 хромосомах. Примерно в этих хромосомах находятся около 500 (200-700) копий генов рРНК, если 700 то у человека очень активный белковый синтез, он сам активен. Если 200 - наоборот.

3