Лекция 9. Биология

Лекция 9. СОСТАВЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ КАРТ ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА.

Впервые в 1911 г. американский ученый Томас Морган выдвинул хромосомную теорию наследственности. Он в качестве объекта исследования использовал муху-дрозофилу. Это оказался отличный генетический объект. Репродуктивный период этого организма составляет 10-12 дней, т. е. из отложенного яйца вылупляется муха и уже через 10 дней дает следующее потомство. Одна самка может дать около 100 потомков. Живет на минимальной питательной среде, питаясь, в основном, дрожжами. Морган при изучении наследования признаков у дрозофилы впервые обнаружил расщепление, не соответствующее 3 закону Менделя (закону независимого комбинирования признаков у потомков). Как оказалось, часть генов наследовалась вместе, сцеплено, передаваясь из поколения в поколение. Бельгийский ученый Янсенс в это время изучал хромосомы дрозофилы, Морган установил, что у мухи 4 группы сцепления, а Янсенс - что у нее 4 пары хромосом, так была доказана хромосомная теория наследственности.

Основные законы:

1. гены, находящиеся в 1 хромосоме образуют одну группу сцепления;

2. гены располагаются в хромосоме линейно друг за другом;

3. поскольку гомологичные хромосомы в мейозе конъюгируют и образуют кроссинговер, то сцепленные гены могут наследоваться врозь и чем чаще происходит между генами кроссинговер, тем чаще происходит процесс расцепления генов, и чем ближе, тем частота кроссинговера будет ниже.

Число групп сцепления генов равно гаплоидному набору хромосом, т. е. у человека 23, у мыши 20, дрозофилы 4 и т. д. Морган доказал, что гены находятся в хромосоме в строго определенном участке.

Огромное значение для картирования генов сыграло предположение о том, что расстояние между 2 генами можно охарактеризовать частотой рекомбинаций, кроссинговеров. Цитологический обмен между хромосомами происходит в хиазмах, переплетениях. Однако, как оказалось, не каждая хиазма приводит к кроссинговеру. Число хиазм, ведущих к рекомбинации в два раза больше числа рекомбинантов, т. е. к кроссинговеру приводит только каждая вторая хиазма.

Единицей хромосомной карты (Θ, тэта) служит расстояние, на котором в среднем происходит 1 кроссинговер на 100 гамет, это стали называть сантиморганиды (сМ), т. е. 1% рекомбинации – это одна сантиморганида. Если, например, два гена удалены друг от друга на 20 единиц хромосомной карты (20 сМ), то 20 гамет из 100 обнаруживают кроссинговер, а на цитологическом уровне можно увидеть 40 хиазм между этими участками. Исследуя частоту хиазм можно определить генетическую длину хромосом. Например, длина х-хромосомы от 160 до 250 сМ, общая длина всех аутосом 2650 – 3333 сМ. Такие колебания связаны с тем, что частота кроссинговеров у женщин в 2 раза выше, чем у мужчин. Этот феномен распространяется практически на весь животный мир, причина непонятна. У самцов дрозофилы вообще нет кроссинговера.

Моргановское картирование хромосом. Представим женский организм, у которого все доминантные гены в одной хромосоме, а рецессивные – в другой. Скрещиваем с самцом – рецессивной гомозиготой.

P: ♀ ABC x ♂ abc abc abc
G:	ABC abc	I: Abc aBC	II: ABc abC	дв.: aBc AbC	abc
F:	ABC abc abc abc (88%)	Abc aBC abc abc (6%)	ABc abC abc abc (4%)	aBc AbC abc abc (2%)
I AB (расстояние между участками): 6+2=8сМ
II BC: 4+2=6 сМ

На этом принципе Морган создал генетические карты дрозофилы. Большая часть генов дрозофилы была создана на основе этого метода. Естественно, ученые попытались создать нечто похожее для человека. Но здесь оказалось много трудностей:

1. нельзя в нужном направлении провести скрещивание;

2. очень длительный репродуктивный период;

3. нужно знать, в каком положении находятся гены человека (цис- или транс-);

4. большое количество хромосом.

AB Ab

ab (цис-положение) aB (транс-положение)

Если в цис-положении АВ и аb не кроссоверные, то в транс-положении все наоборот.

Наиболее хорошо на первом этапе была изучена х-хромосома человека. Впервые американский ученый МакКьюсик предложил особый метод по составлению генетических карт х-хромосом. Во-первых, он попытался составить генетическую карту расстояния для дальтонизма и гемофилии. Эти два гена давно известны. Если женщина имеет расположение в цис-фазе, а у мужчины есть обе патологии, тогда в потомстве один сын нормальный, некроссоверный, у второго есть обе аномалии, следующий сын кроссоверный с нормальным зрением и гемофилией, еще один следующий кроссоверный дальтоник без гемофилии.

P: ♀DG x ♂dg dg

F: DG (обе аномалии) dg (здоровый) <некроссоверные> ; Dg (дальтоник) dG (болен гемофилией) <кроссоверные>

Мы не знаем, в каком положении находятся гены у матери, если мать будет иметь гены в транс-положении, то все будет наоборот, одни кроссоверные, другие нет. Это метод МакКьюсика получил название метода ДЕДА. Метод заключается в том, что надо смотреть на отца этой матери, если отец будет dG или Dg, то дочь в цис-положении, а если отец будет DG или dg, то дочь в транс-положении. В связи с этим можно точно говорить, какие потомки кроссоверные, а какие нет. Всего он посмотрел около 107 семей, где встречаются обе аномалии и выявил следующие закономерности, что из 100 семей - с кроссинговером 5 человек, следовательно, расстояние между генами гемофилии и дальтонизма 5 сМ. Он картировал х-хромосому у человека, определяя расстояние между генами дальтонизма и гемофилии, но для этого требовалось установить, как эти гены расположены: в цис- (в одной и той же хромосоме) или в транс- (в разных хромосомах). После чего было определено количество кроссоверных потомков у матерей и установлено расстояние между генами дальтонизма и гемофилии.

Дальнейший этап картирования хромосом связан с изучениями хромосомных перестроек в кариотипе человека, особенно перестроек, связанных с удвоением числа хромосом, дубликацией участков хромосом, утратой хромосомы и делецией (утратой участка хромосомы). В таких клетках у такого человека определяют, что исчезает и что добавляется? какие ферменты исчезают? И видя в хромосоме утрату, устанавливают, что в этом участке находится ген, который определяет синтез того или иного фермента. Особенно много исследований в этом направлении появилось после того, как возникла дифференциальная окраска хромосом, и стало возможным сегментирование участков хромосом.

Следующий этап – это появление метода гибридизации соматических клеток, когда происходит слияние клеток человека и мыши либо хомяка, при этом образуется гибридная клетка синкарион, в которой происходит утрата человеческих хромосом, постепенно возникают клетки, содержащие все хромосомы мыши и 1 хромосому человека. И опять же определяют, что лишнее продуцирует эта клетка относительно нормальной мышиной клетки. Такое слияние проводят с помощью вируса Сендай или полиэтиленгликоля. Затруднение заключается в том, что мы можем установить, какие ферменты, вернее гены каких ферментов находятся в данной хромосоме. Обычно это состояние называют синтенность, приуроченность к какой либо хромосоме.

Установить расстояние между генами предложили американские ученые Госс и Харльз. Они назвали свой метод методом дробления. Такие гибридные клетки, содержащие 1 хромосому человека, облучали мощным рентгеновским пучком, и хромосома начинала распадаться на куски. И далее смотрели, какие ферменты утрачиваются в клетке с делетированной хромосомой, когда видят, что утрачиваются эти 2 фермента, говорят, что эти ферменты синтенны, они сцеплены друг с другом. Т. о. были проанализированы практически все хромосомы человека, была установлена локализация более 1,5 тыс. генов.

С 1990 года началась новая эпоха картирования хромосом человека, был запущен проект «Геном человека». Был использован совершенно новый метод. В основе метода лежит вариант метода Сэнгера или метод секвенирования ДНК, т. е. метод определения последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК. Если взять от 46 хромосом у человека молекулы ДНК, то длина будет около 2 метров, было установлено, что в этой ДНК 3,2 млрд пар нуклеотидов и нужно было по одному нуклеотиду определить всю последовательность, как они сцеплены друг с другом.

В методе Сенгера одна из цепочек ДНК выступает в качестве матрицы, на ней с помощью ДНК-полимеразы синтезируется комплементарная цепь, т. е. сперва нужно раскрутить молекулы ДНК, обычно это делают при повышении температуры. Цепи ДНК отходят друг от друга. Реакцию обычно проводят в 4 пробирках. Здесь нужен праймер – небольшой участок ДНК, который комплементарен началу молекулы ДНК. ДНК-полимераза не может начинать считывание с пустого места, она только присоединяет нуклеотиды к 3'-гидроксильной группе, это затравка. Необходим дезоксинуклеотид, меченый радиоактивно, часто метят Р₃₂, это позволяет в дальнейшем определить, где произошел синтез. Кроме того, в эту смесь вводят 4 дезоксинуклеотида, чтобы протекал синтез. На сегодняшний день синтезирование по Сенгеру полностью автоматизировано, используются приборы секвенаторами, которые могут за 1 раз прочитать последовательность около 1000 нуклеотидов. Т. о. в настоящее время как бы существует три типа генетических карт хромосом человека:

1. генетические карты, созданные с помощью метода Моргана, измерение в сМ, но оказалось, что в разных местах хромосомы (в гетерохроматине или эухроматине) кроссинговер идет по-разному, поэтому это измерение чисто физиологическое, а не физическое;

2. физические карты хромосом создаются на основе изучения под микроскопом дифференциально окрашенных хромосом, когда определенной зоне хромосом присваивается номер и устанавливается, какие гены находятся в этом участке;

3. секвенцерные хромосомы, когда участок ДНК разбивается на отдельные нуклеотиды, измерение при этом идет в т.н. Мb (мегабазах), 1 Мb – это примерно 1 млн нуклеотидов. Метод секвенциса позволяет проводить определение участков до 1 нуклеотида. Однако ученые не могут эту последовательность приурочить к определенному гену, известно только 3%

В настоящий момент у человека насчитывают около 30000 генов. В настоящее время использование новых устройств для синтезирования позволяет расшифровывать со скоростью около 500 Mb в год и стоимость этой работы 0,25 $ за нуклеотид. Результаты завершающей части проекта показали, что большая часть генов ацитилированных связаны с устройством и работой головного мозга, поэтому очевидно, что практически любое нарушение в генетическом аппарате приводит к резкому снижению интеллекта. Из 10 тысяч известных болезней половина – это наследственные болезни, они вызваны изменениями в генетическом аппарате, поэтому одно из направлений – это выявить, что сломано в генетическом аппарате и, может быть, появятся методы, с помощью которых можно будет помочь больному.

Кроме этого, данные по бактериям, животным и прочие помогли построить эволюционную лестницу существ. До последнего времени к прокариотам относили еще более примитивные археобактерии которые резко отличаются от других микробов, однако стало ясно, что это совершенно другая ветвь эволюции. Кроме того, данный метод позволил по-новому взглянуть на эволюцию человека. Стали создавать генетические паспорта людей (особенно в США), где обязательно прописаны те гены, изменение которых может приводить к заболеваниям.

3