Репликация днк Полуконсервативный механизм репликации

Для того чтобы объяснить, каким образом может самокопироваться, или редуплицироваться, такая стабильная и замкнутая на себя структура, как двойная спираль ДНК, Уотсон и Крик предположили, что ее цепи способны к раскручиванию и последующему частичному разделению вследствие разрыва водородных связей в каждой комплементарной паре оснований. Образовавшиеся одноцепочечные участки родительской молекулы могут служить матрицей, к которой на основе комплементарности оснований присоединяются соответствующие нуклеотиды. Эти нуклеотиды скрепляются между собой фосфодиэфирными связями с образованием новой цепи, комплементарной родительской. Так как этот процесс происходит на каждой разделившейся цепи исходной молекулы, то в результате образуются две двухцепочечные структуры, идентичные родительской ДНК. Такой способ репликации получил название полуконсервативного, поскольку в каждой из вновь образовавшейся молекул одна цепь является старой (родительской), а другая - вновь синтезированной (дочерней). Этот механизм обеспечивает возможность такого распределения ДНК между делящимися клетками, при котором каждая дочерняя клетка получает гибридную двухцепочечную молекулу ДНК, состоящую из родительской и вновь синтезированной цепи.

Первые данные в пользу гипотезы полуконсервативного механизма синтеза ДНК были получены Дж. Тейлором с соавторами (1957) цитологическим методом при изучении репликации хромосом конских бобов (Vicia faba). Экспериментально эта гипотеза была доказана с помощью физико-химических методов М. Мезельсоном и Ф. Сталем (1958). Сущность их метода заключалась в следующем: бактерии E.coli на протяжении многих генераций выращивали в среде, содержащей в качестве источника азота только его тяжелый изотоп ¹⁵N. Эта метка включалась в азотсодержащие пуриновые и пиримидиновые основания в ДНК, вследствие чего ДНК в клетках, выращенных среде с ¹⁵N, имела большую молекулярную массу на единицу объема (т.е. большую плотность), чем ДНК в клетках, выращенных в обычных условиях, в присутствии легкого изотопа ¹⁴N. Поэтому, если клетки после длительного выращивания на среде с ¹⁵N отмывали и переносили на время, равное одной, двум и т.д. генерациям, в среду с ¹⁴N вместо ¹⁵N, то это должно было привести к появлению молекул ДНК с меньшей плотностью. Различающиеся по плотности молекулы можно разделить с помощью метода равновесного ультрацентрифугирования в градиенте плотности 6М CsCl. Оказалось, что вся ДНК, выделенная из клеток, выращенных в течение одной генерации в среде с ¹⁴N, располагается в градиенте CsCl в положении, промежуточном между положением “тяжелой” ДНК из клеток, выращенных только в среде с ¹⁵N, и “легкой” ДНК из клеток, выращенных только в среде с ¹⁴N. Это значит, что по прошествии одной генерации после переноса из среды с ¹⁵N в среду с ¹⁴N, в клетках появилась гибридная по плотности ДНК, у которой одна цепь была “тяжелой”, а другая - “легкой”. Если ДНК выделяли из клетки через две генерации после такого переноса, то “гибридная” ДНК составляла лишь половину всей ДНК, распределяющейся в градиенте плотности CsCl, а другая половина располагалась в зоне, соответствующей по плотности молекулам, включавшим только ¹⁴N. В следующем поколении эта “легкая” фракция увеличивалась и составляла 75% тотальной ДНК. Такое изменение можно объяснить только с позиций представления о полуконсервативном способе репликации ДНК.

Сделанный Мезельсоном и Сталем вывод был полностью подтвержден и для других объектов, включая животных и высшие растения. Вместе с тем, оставалось неясным, в каком направлении происходит репликация ДНК и какие ферменты обеспечивают этот процесс. Ответ на первый вопрос удалось получить Дж. Кэрнсу (1963) в опытах на E.coli. Он поставил своей задачей сделать процесс репликации ДНК видимым, для чего использовал метод авторадиографии. Этот метод позволяет обнаруживать и локализовывать радиоактивную метку, включающуюся в молекулы ДНК, РНК, либо белка путем их помещения на чувствительную к радиации фотоэмульсию. ДНК можно специфично метить, если выращивать клетки с ³Н-тимидином, являющимся дезоксирибонуклеозидом тимина. Тимидин избирательно включается в ДНК, поэтому выращивание клеток E.coli в среде с меченым по тритию тимидином позволяет следить за распределением метки по мере ее включения во вновь синтезирующуюся ДНК. Поскольку крупные молекулы ДНК легко разрываются при механических повреждениях, Кэрнс разработал такую технику, при которой клетки разрушались ферментом лизоцимом, а ДНК из лизированных клеток собирали на мембранных фильтрах, помещаемых на стекла, покрытые фотоэмульсией, чувствительной к -частицам, выделяющимся при распаде трития. Радиоавтографы, полученные после проявления таких фотографических стекол, выдерживавшихся предварительно в темноте до образования зерен металлического серебра, показали, что хромосома E.coli имеет кольцевидную форму и во время своей репликации образует структуры в форме греческой буквы . Обнаружение подобных структур, являющихся формами молекул ДНК в процессе их репликации, показывало, что раскручивание двух комплементарных цепей родительской ДНК и их полуконсервативная репликация происходят практически одновременно и начинаются в общей точке начала репликации, обозначаемой как локус ori (от англ. origin- начало). Последующий анализ результатов опыта Кэрнса и данные других экспериментаторов, нацеленных на изучение механизма репликации ДНК у различных бактерий, фагов, плазмид, показали, что в большинстве случаев она происходит двунаправлено и начинается, как правило, от одного уникального локуса ori. В этом месте в одной из цепей ДНК разрывается фосфодиэфирная связь, обеспечивающая последующее раскручивание дуплекса и образование особых структур - репликативных вилок, движущихся в противоположных направлениях по кольцевой ДНК. Следует, однако, отметить, что в ДНК эукариот, как правило, обнаруживается не один, а множество локусов ori, что, по-видимому, служит необходимым условием для того, чтобы громадные молекулы ДНК в хромосомах эукариот успели полностью отреплицироваться за время одного клеточного цикла.

Эксперименты, проведенные на прокариотах (E.coli, T7, некоторые плазмиды), также выявили в их ДНК (скорость репликации которых составляет около 20 мкм/мин, что в 20-30 раз выше, чем у эукариот) не по одному, а по два или даже более локусов ori. Среди этих локусов наблюдается подчиненность: когда активен главный ori, остальные могут не функционировать, и, напротив, в случае выключения главного ori запасные ori обеспечивают репликацию ДНК. Очевидно, такая зависимость обеспечивает стабильность важнейшей функции ДНК - ее способности к репликации.