2. Неконкурентное ингибирование

Неконкурентным называют такое ингибирование ферментативной реакции, при котором ингибитор взаимодействует с ферментом в участке, отличном от активного центра (рис. 6). Неконкурентные ингибиторы не являются структурными аналогами субстрата.

Неконкурентный ингибитор может связываться либо с ферментом, либо с фермент-субстратным комплексом, образуя неактивный комплекс. Присоединение неконкурентного ингибитора вызывает изменение конформации молекулы фермента таким образом, что нарушается взаимодействие субстрата с активным центром фермента, что приводит к снижению скорости ферментативной реакции.

Кинетические зависимости

Кинетическая зависимость неконкурентного ингибирования представлена на рис. 7. Этот тип ингибирования характеризуется снижением V_maxферментативной реакции и уменьшением сродства субстрата к ферменту, т.е. увеличением К_m.

Б. Необратимое ингибирование

Необратимое ингибирование наблюдают в случае образования ковалентных стабильных связей между молекулой ингибитора и фермента. Чаще всего модификации подвергается активный центр фермента, В результате фермент не может выполнять каталитическую функцию.

К необратимым ингибиторам относят ионы тяжёлых металлов, например ртути (Hg²⁺), серебра (Ag⁺) и мышьяка (As³⁺), которые в малых концентрациях блокируют сульфгидрильные группы активного центра. Субстрат при этом не может подвергаться химическому превращению (рис. 8). При наличии реактиваторов ферментативная функция восстанавливается. В больших концентрациях ионы тяжёлых металлов вызывают денатурацию белковой молекулы фермента, т.е. приводят к полной инактивации фермента.

1. Специфические и неспецифические ингибиторы

Использование необратимых ингибиторов представляет большой интерес для выяснения

Рис. 5. Схема активного центра ацетилхолинэстеразы.А - присоединение ацетилхолина в активном центре фермента. Стрелкой указано место гидролиза эфирной связи в молекуле ацетилхолина; Б - присоединение конкурентного ингибитора - прозерина в активном центре фермента. Указано место гидролиза прозерина, однако реакция идёт намного медленнее, чем с ацетилхолином; В - присоединение конкурентного ингибитора в активном центре фермента - эндрофония. Эндрофоний связывается в активном центре ацетилхолинэстеразы, препятствуя присоединению ацетилхолина.

Использование необратимых ингибиторов представляет большой интерес для выяснения механизма действия ферментов. С этой целью применяют вещества, блокирующие определённые группы активного центра ферментов. Такие ингибиторы называют специфическими. Ряд соединений легко вступает в реакции с определенными

Рис. 6. Схема неконкурентного ингибирования активности фермента.

химическими группами. Если эти группы участвуют в катализе, то происходит полная инактивация фермента.

Роль гидроксильных групп серина в механизме катализа исследуют с помощью фторфосфатов, например диизопропилфторфосфата. Дии-зопропилфторфосфат (ДФФ) специфически реагирует лишь с одним из многих остатков серина в активном центре фермента. Остаток Сер, способный реагировать с ДФФ, имеет идентичное или очень сходное аминокислотное окружение (табл. 1). Высокая реакционная способность этого остатка по сравнению с другими остатками Сер обусловлена аминокислотными остатками, также входящими в активный центр ферментов.

ДФФ относят к специфическим необратимым ингибиторам "сериновых" ферментов, так как он образует ковалентную связь с гидроксильной группой серина, находящегося в активном центре и играющего ключевую роль в процессе катализа (рис. 9).

Ацетат йода, п-хлормеркурибензоат легко вступают в реакции с SH-группами остатков цистеина белков. Эти ингибиторы не относят к специфичным, так как они

Рис. 7. Влияние неконкурентного ингибитора на скорость ферментативной реакции в зависимости от концентрации субстрата.V_max- максимальная скорость реакции в отсутствие ингибитора; 'V_max- максимальная скорость реакции в присутствии ингибитора; К_m- константа Михаэлиса в отсутствие ингибитора; 'К_m- константа Михаэлиса в присутствии ингибитора.

Рис. 8. Механизм действия ионов ртути как необратимого ингибитора.Ионы ртути в малых концентрациях блокируют сульфгидрильные группы активного центра, что приводит к снижению скорости ферментативной реакции.

Рис. 9. Ингибирование активности химотрипсина с помощью диизопропилфторфосфата.

Таблица 1. Исследование последовательности аминокислотных остатков вокруг реакционно-способного остатка се-рина, взаимодействующего с ДФФ

Фермент	Функция ферментов (подкласс ферментов)	Аминокислотные остатки, находящиеся в окружении реакционно-способного серина в активном центре
Химотрипсин	Протеолитические ферменты	Асп Сер Глу
Трипсин		Асп Сер Глу
Тромбин		Асп Сер Глу
Эластаза		Асп Сер Глу
Холинэстераза	Эстеразы (гидролиз эфирной связи)	Глу Сер Ала
Щелочная фосфатаза		Глу Сер Ала

реагируют с любыми свободными SH-группами белков и называются неспецифическими ингибиторами. Если SH-группы принимают участие непосредственно в катализе, то с помощью этих ингибиторов представляется возможным выявление роли SH-групп фермента в катализе.