28. Установлено, что все известные в настоящее время ферменты представляют собой белки.

Ферменты обладают теми же физико-химическими свойствами, что и белки. Их молекулярная масса колеблется от десятков тысяч до нескольких миллионов. По форме молекул ферменты относятся к глобулярным белкам.

Все ферменты подразделяют на две большие группы: о д н о к о м п о н е н т н ы е и д в у х к о м п о н е н т н ы е. К первой группе относят ферменты, состоящие только из белка, а ко второй - состоящие из белка и связанной с ним небелковой части (активная группа или кофактор). Белковая часть двухкомпонентного фермента носит название а п о ф е р м е н т, небелковая часть - п р о с т е т и ч е с к а я группа или кофермент, а молекула в целом - х о л о ф е р м е н т.

Прочность связи между белковой и небелковой частями у различных ферментов различна. В связи с этим небелковую часть, сравнительно прочно связанную с апоферментом называют п р о с т е т и ч е с к а я группа, а небелковую часть, сравнительно легко удаляющуюся через полупроницаемую мембрану при диализе - к о ф е р м е н т.

В качестве кофакторов двухкомпонентных ферментов может функционировать значительное число органических и неорганических веществ. Из органических соединений функцию кофакторов выполняют многие витамины, нуклеотиды (ФМН и др.), динуклеотиды (НАД, НАДФ, ФАД), железопорфирины (гем и гематин), липоевая кислота, и другие соединения.

Из неорганических веществ функцию кофакторов выполняют ионы различных металлов: цинка, меди, железа, молибдена, никеля, марганца, магния, кальция и др. В одних ферментах металлы бывают довольно прочно связаны с белком и не отделяются от него в процессе очистки. В других ферментах металл непрочно связан с белком и легко отделяется от него в процессе очистки.

Ферментативный катализ – каталитические реакции, протекающие с участием ферментов – биологических катализаторов белковой природы. Ферментативный катализ имеет две характерные особенности:

1. Высокая активность, на несколько порядков превышающая активность неорганических катализаторов, что объясняется очень значительным снижением энергии активации процесса ферментами. Так, константа скорости реакции разложения перекиси водорода, катализируемой ионами Fе2+, составляет 56 с-1; константа скорости этой же реакции, катализируемой ферментом каталазой, равна 3.5·107, т.е. реакция в присутствии фермента протекает в миллион раз быстрее (энергии активации процессов составляют соответственно 42 и 7.1 кДж/моль). Константы скорости гидролиза мочевины в присутствии кислоты и уреазы различаются на тринадцать порядков, составляя 7.4·10-7 и 5·106 с-1 (величина энергии активации составляет соответственно 103 и 28 кДж/моль).

2. Высокая специфичность. Например, амилаза катализирует процесс расщепления крахмала, представляющего собой цепь одинаковых глюкозных звеньев, но не катализирует гидролиз сахарозы, молекула которой составлена из глюкозного и фруктозного фрагментов.

Согласно общепринятым представлениям о механизме ферментативного катализа, субстрат S и фермент F находятся в равновесии с очень быстро образующимся фермент-субстратным комплексом FS, который сравнительно медленно распадается на продукт реакции P с выделением свободного фермента; т.о., стадия распада фермент-субстратного комплекса на продукты реакции является скорость определяющей (лимитирующей).

F + S <––> FS ––> F + P

Исследование зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при неизменной концентрации фермента показали, что с увеличением концентрации субстрата скорость реакции сначала увеличивается, а затем перестает изменяться.

Здесь Кm – константа Михаэлиса, численно равная концентрации субстрата при V = ½Vmax. Константа Михаэлиса служит мерой сродства между субстратом и ферментом: чем меньше Кm, тем больше их способность к образованию фермент-субстратного комплекса.

Характерной особенностью действия ферментов является также высокая чувствительность активности ферментов к внешним условиям – рН среды и температуре. Ферменты активны лишь в достаточно узком интервале рН и температуры, причем для ферментов характерно наличие в этом интервале максимума активности при некотором оптимальном значении рН или температуры; по обе стороны от этого значения активность ферментов быстро снижается.

29. Кинетика ферментативных реакций. Этот раздел энзимологии изучает влияние хими ческих и физических факторов на скорость ферментативной реакции. В 1913 г. Михаэлис и Ментен создали теорию ферментативной кинетики, исходя из того, что фермент (Е) вступает во взаимодействие с субстратом (S) с образованием промежуточного ферментсубстратного комплекса (ЕS), который далее распадается на фермент и продукт реакции по уравнению:

Каждый этап взаимодействия субстрата с ферментом характеризуется своими константами скорости. Отношение суммы констант скорости распада ферментсубстратного комплекса к константе скорости образования ферментсубстратного комплекса называется константой Михаелиса (Кm). Она определят сродство фермента к субстрату. Чем ниже константа Михаелиса, тем выше сродство фермента к субстрату, тем выше скорость ка тализируемой им реакции. По величине Кm каталитические реакции можно поделить на быстрые (Кm 106 моль/л и меньше) и медленные ( Кm 102 до 106).

Скорость ферментативной реакции зависит температуры, реакции среды, концентрации реагирующих веществ, количества фермента и других факторов.

1. Рассмотрим зависимость скорости реакции от количест ва фермента. При условии избытка субстрата скорость реакции пропорциональна количеству фермента, но при избыточном количестве фермента прирост скорости реакции будет сни жаться, поскольку уже не будет хватать субстрата.

2. Скорость химических реакций пропорциональна концентрации реагирующих ве ществ (закон действующих масс). Этот закон применим и для ферментативных реакций, но с определенными ограничениями. При постоянных количествах фермента скорость реакции действительно пропорциональна концентрации субстрата, но, только в области низких концен траций. При высоких концентрациях субстрата наступает насыщение фермента субстратом, то есть наступает такой момент, когда уже все мо лекулы фермента задействованы в каталитическом процессе и прироста скорости реакции не будет. Скорость реакции выходит на макси мальный уровень (Vmax) и дальше уже не зависит от концентрации субстрата. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата следует определять в той части кривой, кото рая ниже Vmax. Технически легче определить не максимальную скорость, а ½ Vmax. Этот параметр является главной характеристикой ферментативной реакции и дает возможность определить константу Михаелиса (Кm).

Кm (константа Михаэлиса) – это такая концентрация субстрата, при которой ско рость ферментативной реакции равна по ловине максимальной. Отсюда выводится уравнение Михаэлиса–Ментена скорости ферментативной реакции.

30. А к т и в н ы й ц е н т р. Известно, что размеры ферментов намного превышают размеры субстратов или функциональных групп, на которые они действуют. Это дало основание предполагать, что субстрат соединяется не со всей молекулой фермента, а с отдельным его участком, получившим название “а к т и в н ы й ц е н т р”, т.е. та область фермента, в которой происходит связывание и превращение субстрата.

Активный центр образуется радикалами аминокислотных остатков полипептидной цепи при формировании ее третичной структуры; у двухкопонентных ферментов в состав активного центра входят и некоторые группировки небелковой части. Достройка активного центра двухкомпонентных ферментов происходит после взаимодействия апофермента с небелковой частью. Нарушение третичной структуры фермента под влиянием различных факторов приводит к дефомации активного центра и изменению ферментативной активности.

Наиболее часто в состав активных центров ферментов входят радикалы серина, гистидина, треонина, цистеина, аргинина, аспарагиновой и глутаминовой кислот.

Активный центр функционально неоднороден; в нем условно выделяют “каталитически активный” участок, где происходит превра-щение субстрата (расщепление или синтез связи), и так называемый контактный или “якорный” участок, который обеспечивает связывание субстрата с ферментом.

В молекуле фермента может присутствовать а л л о с т е р и ч е с к и й центр, представляющий собой участок молекулы, присоединение к которому определенных веществ приводит к изменению третичной структуры молекулы фермента. В результате этого происходит изменение конфигурации активного центра, сопровождающееся либо увеличением, либо снижением каталитической активности фермента. Это явление лежит в основе так называемой аллостерической регуляции активности ферментов. Ферменты, активность которых регулируется веществами, присоединяющимися к аллостерическому центру, получили название а л л о с т е р и ч е с к и х ферментов.

Начальная скорость ферментативной реакции при условии избытка субстрата пропорциональна концентрации фермента: vkE, где k - константа скорости реакции; Е - концентрация фермента. При графическом изображении этой зависимости получается прямая линия.

Начальная скорость ферментативной реакции будет прямо пропорциональна концентрации присутствующего фермента. Любое наблюдаемое отклонение от линейной зависимости вовсе не означает изменения того очевидного принципа, что две молекулы фермента вызовут превращение в результате реакции в два раза большего ( по сравнению с одной молекулой) количества вещества. Отсутствие линейной зависимости между скоростью реакции и концентрацией фермента свидетельствует о влиянии какого-то фактора, усложняющего ход реакции. Такими факторами - если мы не имеем дело со слишком быстро протекающей реакцией, в связи с чем данный метод оказывается непригодным для изучения ее кинетики, - могут быть присутствие в реакционной среде ингибитора или феномен подавления реакции ее продуктом. Обычно такое кажущееся отклонение обусловлено тем, что с помощью данного метода определения активности фермента мы на самом деле измеряем не истинную начальную скорость реакции, а лишь скорость на ранних этапах реакции. Таким образом, обнаружение нелинейной зависимости между скоростью реакции и концентрацией фермента должно прежде всего заставить исследователя критически проанализировать детали используемого метода, прежде чем пытаться строить предположения о новых принципах кинетики данной реакции.

Зависимость начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата для гидролиза метилового эфира Ы - ацетил - Ь - валина, катализируемого а-химотрипсином.

Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата - кривая Михаэлиса. Зависимость начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата ( рис. 16) показывает, что при низких концентрациях субстрата наблюдается отчетливая зависимость между его концентрацией и скоростью реакции. При избытке субстрата скорость реакции постоянна и называется максимальной скоростью.

В число основных факторов, определяющих начальную скорость ферментативной реакции, входят концентрация фермента и субстрата, рН и температура, наличие активаторов и ингибиторов, причем концентрация субстрата является одним из наиболее важных. График зависимости между начальной скоростью и концентрацией субстрата выражается в виде ветви равнобочной гиперболы. Краеугольным камнем ферментативной кинетики является теория Михаэлиса-Ментен о механизме взаимодействия фермента и субстрата через образование промежуточного фермент-субстратного комплекса, что является исходным моментом самых современных концепций. Теория исходила из факта, что равновесие между ферментом и субстратом достигается быстрее, чем разрушается фермент-субстратный комплекс. Однако анализ, проведенный Бригсом и Холдейном, показал, что в любой момент реакции скорости образования и распада фермент-субстратного комплекса практически равны, то есть достигается стационарное состояние, в котором концентрация промежуточного соединения постоянна. При этом все параметры уравнения имеют физический смысл и позволяют учитывать их на практике при использовании применительно к своему ферменту и условиям реакции.

В число основных факторов, определяющих начальную скорость ферментативной реакции, входят концентрация фермента и субстрата, рН и температура, наличие активаторов и ингибиторов, причем концентрация субстрата является одним из наиболее важных. График зависимости между начальной скоростью и концентрацией субстрата выражается в виде ветви равнобочной гиперболы. Краеугольным камнем ферментативной кинетики является теория Михаэлиса-Ментен о механизме взаимодействия фермента и субстрата через образование промежуточного фермент-субстратного комплекса, что является исходным моментом самых современных концепций. Теория исходила из факта, что равновесие между ферментом и субстратом достигается быстрее, чем разрушается фермент-субстратный комплекс. Однако анализ, проведенный Бригсом и Холдейном, показал, что в любой момент реакции скорости образования и распада фермент-субстратного комплекса практически равны, то есть достигается стационарное состояние, в котором концентрация промежуточного соединения постоянна.

Кат и / Ст ( каж), определенные из начальных скоростей ферментативной реакции, равны 57 4 сек - и 1 6 10 - 3 М соответственно.

Ингибирование субстратом. Согласно уравнению Михаэлиса - Ментен (6.8), при увеличении концентрации субстрата начальная скорость ферментативной реакции гиперболически возрастает, стремясь к своему предельному значению.

Согласно уравнению Михаэлиса - Ментен (5.7), при увеличении концентрации субстрата начальная скорость ферментативной реакции гиперболически возрастает, стремясь к своему предельному значению, называемому максимальной скоростью реакции. Однако в ряде случаев при увеличении концентрации субстрата начальная скорость ферментативной реакции проходит через максимум и затем уменьшается.

Определение индивидуальных констант скоростей гидролиза этилового эфира L-тирозина, катализируемого а-химотрипсином, в присутствии дополнительного нук-леофильного агента ( 1 4-бутандиола ( по данным А. А. Клесова, если концентрация 1 4-бутандиола, М. 1 - 0. 2 - 0 11. 3 - 0 22.| Определение отношения kulki в реакции сольволиза М - ацетил - L - норвалилхимотрипсина метанолом ( N и водой при концентрации субстрата этилового эфира М - ацетил-1 - норвалина ( мМ. 1 - О. 2 - 25. 3 - 17. 4 - 10. Анализ кинетических данных ферментативных реакций можно проводить как с использованием начальных скоростей ( по зависимости начальной скорости ферментативной реакции от начальной концентрации субстрата или эффектора, как это было показано в предыдущих параграфах), так и с использованием временного хода реакции, применяя интегральную форму кинетического уравнения скорости.

Обработка с помощью уравнения полной кинетической кривой гидролиза n - нитрофенилфосфата под действием щелочной фосфатазы ( Д 1 час.| Необычный ход прямой, приводящий к отрицательным значениям кинетических параметров гидролиза бромацетил - ОЬ-фенил-лактата, катализируемого карбо-ксипептидазой, полученный при обработке полной кинетической кривой с помощью интегральной формы уравнения скорости. Подставляя в выражения (8.28), (8.29) значения Vm и / Ст ( каж), определенные из начальных скоростей ферментативной реакции, можно найти величину константы ингибирования фермента продуктом реакции.

При сравнении результатов измерения скоростей обычным методом и методом все или ничего было показано, что константа начальной скорости ферментативной реакции, измеренная обычным путем, примерно равна сумме констант скоростей модификации метиошша и гистидина, однако константа скорости процесса инактивации, измеренная методом все или ничего, равна скорости модификации гистидина. Следовательно, можно сделать вывод, что при окислении гистидина образуется неактивным фермент, в то время как при окислении метионина образуется фермент, частично сохраняющий активность.

Обработка с помощью уравнения полной кинетической кривой гидролиза n - нитрофенилфосфата под действием щелочной фосфатазы ( А 1 час.| Необычный ход прямой, приводящий к отрицательным значениям кинетических параметров гидролиза бромацетил - ОЬ-фенил-лактата, катализируемого карбо-ксипептидазой, полученный при обработке полной кинетической кривой с помощью интегральной формы уравнения скорости. Подставляя в выражения (8.28), (8.29) значения Vm и / С Г1 ( каж), определенные из начальных скоростей ферментативной реакции, можно найти величину константы ингибирования фермента продуктом реакции.

Найти значение константы конкурентного ингибирова-ния продуктом реакции, если значения & Кат и / Ст ( наж), определенные из начальных скоростей ферментативной реакции, равны 57 4 сек - и 1 6 - Ю 3 М соответственно.

Согласно уравнению Михаэлиса - Ментен (5.7), при увеличении концентрации субстрата начальная скорость ферментативной реакции гиперболически возрастает, стремясь к своему предельному значению, называемому максимальной скоростью реакции. Однако в ряде случаев при увеличении концентрации субстрата начальная скорость ферментативной реакции проходит через максимум и затем уменьшается.

31. Различают два главных вида специфичности ферментов: субстратную специфичность и специфичность действия. Субстратная специфичность, это способность фермента катализировать превращения только одного определенного субстрата или же группы сходных по строению субстратов. Определяется структурой адсорбционного участка активного центра фермента.

Различают 3 типа субстратной специфичности:

абсолютная субстратная специфичность - это способность фермента катализировать превращение только одного, строго определенного субстрата;

относительная субстратная специфичность - способность фермента катализировать превращения нескольких, сходных по строению, субстратов;

стереоспецифичность - способность фермента катализировать превращения определенных стереоизомеров.

Например, фермент оксидаза L-аминокислот способен окислять все аминокислоты, но относящиеся только к L-ряду. Таким образом, этот фермент обладает относительной субстратной специфичностью и стереоспецифичностью одновременно.

Специфичность действия - это способность фермента катализировать только определенный тип химической реакции.

В соответствии со специфичностью действия все ферменты делятся на 6 классов. Классы ферментов обозначаются латинскими цифрами. Название каждого класса ферментов соответствует этой цифре.

Все факторы, влияющие на развитие микробов, делят на:

Физические

Химические

Ниже подробнее рассмотрим каждый из факторов.