3. Днк зависимые днк полимеразы, днк лигазы

Полимера́за — фермент, главной биологической функцией которого является синтез полимеров нуклеиновых кислот. ДНК-полимераза и РНК-полимераза синтезируют молекулы ДНК и РНК соответственно, в основном, путём комплементарногокопирования родительских цепей ДНК или РНК.

Ферменты, ответственные за сборку других полимеров, не относят к полимеразам. К примеру, ферментативный комплекс, осуществляющий сборку аминокислот в белки, называется рибосомой, а не «белковой полимеразой».

Многие полимеразы, полученные из термофильных бактерий (например, Taq-полимераза из Thermus aquaticus) или архей

. ДНК-лигаза

ДНК-лигаза – это фермент, катализирующий образование фосфодиэфирной связи в двухцепочечной молекуле ДНК, Т.Е. ПРОЦЕСС ЛИГИРОВАНИЯ (СШИВАНИЯ)

ДНК-лигаза фага Т4

– мономерный полипептид (молекулярная масса 68 кДа)

– катализирует образование фосфодиэфирной связи между ‘-фосфатным (5‘-р) и 3 гидроксильным (3‘-ОН) концами ДНК

ДНК-лигаза фагаТ4

обеспечивает объединение любых двуцепочечных фрагментов ДНК , поэтому данный фермент является одним из важнейших ферментов создания рекомбинантных молекул ДНК

Среди ДНК-зависимых ДНК-полимераз наибольшее применение в генной инженерии находят ДНК-полимераза I E. coli и ее большой фрагмент ( фрагмент Кленова ),

. ДНК-полимераза I E. coli (Pol I)

Обнаружена А. Корнбергом в 1958 г.

Мономерный полипептид с молекулярной массой 103 кДа, имеет трехдоменную структуру.

Каждый домен обладает отдельной ферментативной активностью:

N-концевой домен - 5‘-3 ‘-экзонуклеазной; С-концевой - 5‘-3 ‘- полимеразной; средний домен - 3‘-5‘ - экзонуклеазной

Связывается с одноцепочечными участками двойной спирали ДНК в местах одноцепочечных разрывов, а также с концами двухцепочечных молекул ДНК

5‘-3‘- Полимеразная активностьPol I

Фермент осуществляет реакцию синтеза комплементарной цепи ДНК

Необходимы:

-одноцепочечная ДНК-матрица

-комплементарный фрагмент – праймер (затравка) с 3‘-ОН концом

3‘-5‘- Экзонуклеазная активность PolI

Фермент осуществляет реакцию расщепления фосфодиэфирных связей в неспаренных участках ДНК (гидролиз ДНК с 3‘-ОН конца)

В ходе реакции убирается ошибочный нуклеотид на место которого присоединяется правильный, что обеспечивает точность полимеризации, направляемой матрицей

Необходима -одно- или двухцепочечная ДНК-матрица

5‘-3‘- Экзонуклеазная активность PolI

-Фермент осуществляет реакцию расщепления фосфодиэфирной связи одной цепи двухцепочечной ДНК, начиная со свободного 5‘-конца

-Нуклеаза может вырезать с 5‘-конца до 10 нуклеотидов

-Реакция играет важную роль в репарации повреждений ДНК in vivo

Использование ДНК полимеразы Iи ее фрагментов

-PolIиспользуется для ведения меченых дезоксирибонуклеотидов в синтезируемые цепи ДНК путем перемещения одноцепочечного разрыва вдоль двухцепочечной ДНК, в котором 3‘-ОН-конец используется в качестве затравки (ник-трансляция), при этомPolIпрокладывает себе путь с помощью 5‘-3 ‘- экзонуклеазной активности

-Термостабильная Taq-ДНК-полимераза широко используется для проведения ПЦР

Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы IE. coli (PolI)

• Содержит С-концевой и средний домены PolI

• Обладает

  • 5‘-3‘– полимеразной

  • 3‘-5‘– экзонуклеазной активностями

• Используется в методе репарации направляемой праймером

• Секвенирования ДНК по методу Сэнгера

• Заполнения 5‘-выступающих липких концов с образованием тупых

• Введения концевой метки

• Удаления 3‘-выступающих концов рестрикционных фрагментов ДНК

РНК-зависимая ДНК-полимераза (обратная транскриптаза, РНК-полимераза, ревертаза)

• Открыта в 1970 г. Х. Теминым, С. Мизутани и независимо от них Д. Балтимором

• Состоит из двух субъединиц - α(65 кДа) иβ(95 кДа)

• Обладает тремя активностями:

  • ДНК-полимеразной, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК Для синтеза необходим праймер

  • Активностью РНКазы Н, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК-ДНК, но не одно- или двухцепочечную РНК

  • ДНК-эндонуклеазной