Исследование функции фагоцитирующих клеток.

Процесс фагоцитоза состоит из ряда последовательных и взаимос­вязанных стадий. К ним относятся подвижность, хемотаксис, адгезия, поглощение, дегрануляция, образование активных форм кислорода и азота, киллинг и расщепление объекта фагоцитоза.

Определение хемотаксиса лейкоцитов проводят методом миграции в микрофильтрационных камерах или в агарозном геле под влиянием различных хемотаксических факторов (хемоатт­рактантов), к которым относятся некоторые N-формилпептиды бактери­ального просхождения, компоненты комплемента (С3a и С5a), лейкотри­ены, тромбоцитактивирующий фактор, ИЛ-8 и т.д. Все эти ве­щества могут накапливаться в воспалительном очаге и оказывать влия­ние на движение фагоцитов.

Изучение синтеза и экспрессии адгезионных молекул.

За адгезивные свойства нейтрофилов и моноцитов отвечают их по­верхностные рецепторы, называемые селектинами и интегринами. С по­мощью селектинов фагоциты “катаются” по поверхности эндотелиальных клеток перед их твердым прикреплением с помощью интегринов к этой поверхности.

Для оценки адгезии фагоцитов используются определение экспрессии молекул адгезии с помощью МАТ к интегринам (анти­гены CD18, CD11a, CD11b, CD11c) и селектинам (CD62L, CD62E) с помощью проточной цитометрии или непрямой имму­нофлюоресценции, а также оценка способности адгезионных молекул прикрепляться к пластику, стеклу, эпителиальным клеткам in vitro.

Изучение стадии поглощения.

Для изучения поглощения используют бактериальные (St.aureus, St.albus, E.coli и др) и дрожжевые клетки или латексные частицы с подсчетом в окрашен­ных препаратах числа частиц, захваченных нейтрофилами. Анализ таких препаратов может проводиться с помощью светового, люминесцентного микроскопа и проточного цитометра.

Изучение стадии дегрануляции.

Процесс дегрануляции заключается в слиянии фагосомы-вакуоли, содержащей объект фагоцитоза, с лизосомами с образованием фаголизо­сомы, в которой происходит киллинг и разрушение захваченной частицы. Этот процесс оценивают путем определения ферментов, выброшенных в окружающую среду при инкубации опсонизированных частиц с фагоци­тами в присутствии цитохолазина В, который подавляет функцию двигательного аппарата клетки и тем самым подавляет стадию поглоще­ния. Фагоциты освобождают содержимое своих гранул в окружающую среду, где оно может быть идентифицировано соответствующими методами. Наиболее простым является определение миелопероксидазы и лизоцима.

Изучение стадии киллинга и расщепления.

Киллинг микроорганизмов, поглощенных как нейтрофилами, так и моноцитами-макрофагами, осуществляется с помощью кислород-зависимых и кислород-независимых механизмов. В первом случае происходит окис­ление кислорода НАДФ-Н-оксидазной системой, в результате чего обра­зуются активные формы кислорода, обладающие сильным микробоцидным действием. Во втором случае гибель и разрушение микроба происходит под влиянием кислой реакции среды фаголизосомы, гидролитических ферментов и большого числа микробоцидных белков и пептидов.

Для оценки этого звена фагоцитоза используется микробио­логический метод (измерение числа бактерий, выжива­ющих после инкубации с лейкоцитами). Более современной является оценка киллинга с помощью проточно­го цитометра. Метод заключается в определении с по­мощью пропидиума иодида (флюорохрома, дающего красное свечение) числа убитых дрожжевых клеток, образующихся после инкубации дрожжей со взвесью исследуемых лейкоцитов.

Изучение процессов образования активных форм кислорода.

Процесс фагоцитоза сопровождается “рес­пираторным взрывом” - образованием активных форм кислорода (супероксидаз­ный радикал, перекись водорода, синглетный кислород и др.), обладающих выраженными микробоцидными свойствами. Для количественной оценки уровня этих соединений существует большой набор ци­тохимических и биохимических тестов. Наиболее простым и в то же время очень надежным является НСТ-тест. Суть метода заключается в образовании нерастворимых окрашенных зерен формазана при восста­новлении нитросинего тетразолия (НСТ) супероксидным радикалом, об­разующимся при активации фагоцитов. В качестве cтимулятора фагоцитоза используется дрожжевой полисахарид - зимозан. НСТ-тест может проводиться с помощью световой микроскопии или проточной цитометрии.

Нарушение функции макрофагов могут быть обусловлены дефектами гумораль­ных факторов (антител, системы комплемента, цитокинов), не­обходимых для активации клеток или же связаны с нарушением их метаболизма (изменения активности миелопероксидазы, глюкозо-6-фосфатдигдрогеназы, кислой и щелочной фосфатаз, лизосомных гидролаз, нейтральных протеаз).

Генетические изменения моноцитов/макрофагов могут касаться от­дельных их функций: подвижности, хемотаксиса, адгезии (при наруше­нии синтеза и экспрессии адгезионных молекул или их компонентов), бактерицидности (при нарушении кислород-зависимых или кислород-не­зависимых механизмов). Приобретенные иммунодефициты с дефектами функций макрофагов чаще всего развиваются вследствие перенесен­ных инфекций.