6.3.2.2. Определение пролиферативной активности лимфоцитов.

Определение пролиферативного ответа лимфоцитов периферической крови является важнейшим показателем функциональной активности этих клеток. В качестве Т-клеточных митогенов используются фитогемагг­лютинин (ФГА), конканавалин А (Кон А), В-клеточных - митоген лако­носа (МЛ), а также аллогенные клетки. В качестве специфических ан­тигенов применяются чаще всего РРD, кандидозные антигены, стрепто­киназа-стрептодорназа, дифтерийный и столбнячный анатоксины.

Некоторые Т-митогены реагируют с различными субпопуляциями Т-клеток: Кон А преимущественно активирует Т-супрес­соры, ФГА - Т-хелперы синтеза иммуноглобулинов. При оценке резуль­татов пролиферативного ответа на митогены следует учитывать, что эти агенты являются поликлональными стимуляторами, и положительный результат говорит о том, что регулирующие клетки в организме су­ществуют и могут давать ответ на соответствующий стимул.

В настоящее время для оценки пролиферативного ответа на Т-ми­тогены или аллоантигены используется только радиометрический метод с применением ³H- и ¹⁴С-меченного тимидина. Стимулированные лимфоциты инкубируются с изотопом в течение 6-24 часов с последующим осаж­дением клеток на специальных фильтрах и учетом реакции бластной трансформации с помощью жидкостных сцинтилляционных b-cчетчиков.

Эта реакция может быть ослаблена Т-клеточных дефицитах (атаксия-телеангиэктазия, генети­чески детерминированная аплазия тимуса - синдром Ди-Джорджи), онкогематологических заболеваниях, особенно в терминальной стадии, вторичных иммунодефицитах.

6.3.2.3. Количественная оценка популяций и субпопуляций лимфоцитов.

Изучение субпопуляций Т-клеток ранее проводилось с по­мощью реакции Е-розеткообразования, основанной на том, что одним из маркеров Т-лимфоцитов является поверхностный гликопротеин - Е-рецептор (в настоящее время обозначается как CD2), способный взаимодействовать с мембранной структурой эритроцитов барана (Е-розеткообразование) и с адгезионной молекулой LFA-3 на эритроцитах человека - ауто-ро­зеткообразование (ауто-РОК). Этот маркер появляется на мембране пред­шественников Т-лимфоцитов в тимусе и сохраняется на зрелых Т-лимфо­цитах в периферической циркуляции. Кластер CD2 обнаруживается на поверхности естественных киллеров (ЕК), лимфокинактивированных киллеров (LAK), имеющих морфологию больших гранулярных лимфоцитов, а также клеток нелимфоидного ряда. Таким образом, реакция Е-розеткообра­зования является показателем суммы перечисленных клеток, несущих антиген CD2. В связи с этим не рекомендуется использовать Е-розеткообразо­вание для идентификации Т-клеток.

Для оценки субпопуляций Т-лимфоцитов ранее использовался так­же теофиллиновый тест, который в настоящее время в связи с низкой специфичностью не применяется.

Развитие современной техники оценки различных субпопуляций лимфоцитов связано с: 1)разработкой и стандартизацией панели моноклональных антител (МАТ) к различным поверхностным дифференцировочным антигенам кле­ток; 2)появлением нового поколения проточно-цитометрического обору­дования; 3)совершенствованием компьютеризированных методов обработки данных.

В настоящее время с помощью МАТ идентифицировано более 165 по­верхностных антигенов лейкоцитов, опреде­лена их молекулярная масса, химическая структура, функция. Дифференцировочные лейкоцитарные антигены обозначаются как "CD" (кластер дифференцировки) и имеют номера, соответствующие хронологии их открытия. Выявляя поверхностные дифференцировочные маркеры, можно оп­ределить популяцию и субпопуляцию клеток, стадию их дифференцировки и активации, функциональную активность и взаимодействие с другими клетками.

Наиболее значимыми поверхностными маркерами являются: для оп­ределения зрелых Т-лимфоцитов - CD3, Т-хелперов/индукторов - CD4, Т-цитотоксических/супрессоров - CD8, естественных киллеров (NK) - СD16, CD56 и СD57, маркеров ранней активации - CD25, CD71, HLA-DR. Определение поверхностных иммуноглобулинов продолжает оставаться одним из главных методов идентификации В-лим­фоцитов. Надежным методом их определения является также выявление CD19, CD20 и CD22 с помощью МАТ.

Лучшим методом выявления поверхностных маркеров является проточная цитометрия, сущность которой заключается в определении гетерогенности популяций клеток по экспрессируемым маркерам клеточ­ной поверхности. В гематологической клинике основными задачами проточной цитометрии являются: 1)иммунофенотипирование лейкозов и лимфом; 2)анализ распределения клеточной популяции по фазам цикла (ДНК-цитометрия); 3)иммунофенотипирование лимфоцитов, оценка внутриклеточной продукции цитокинов различными клеточными популяциями; 4)анализ процессов активации и пролиферации клеток иммун­ной системы; 5)выявление и мониторинг минимальной остаточной болезни.

Иммунофенотипирование острых лейкозов.

Иммунофенотипирование острых лейкозов с помощью проточной цитометрии проводится в два этапа: сначала определяется разновидность лейкоза (В- или Т-острый лимфобластный лейкоз, острый миелоидный лейкоз), затем подварианты заболевания (В₁-В₅-варианты В-клеточного, Т₁-Т₄-варианты Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза, М0-М7 варианты острого миелоидного лейкоза) - таблицы 6.3.1-6.3.4.

Таблица 6.3.1.