Лебедев К.А - Иммунология в клинической практике / Лебедев К.А - Иммунология в клинической практике

71

А Б

Рис. 4 Схема изменения сопряженности компонентов иммунной системы в динамике её функционирования . А - нормальное функционирование : 1 - здоровье; 2 - активация (острое заболевание, травма); 3 - выздоровление (“новое здоро-

вье”) Б - функционирование при хронических и рецидивирующих процессах : 1,3 - клиническое здоровье (

ремис-сия); 2 - обострение процесса ( рецидив ). По оси ординат - направление возрастания связанности.

Высокий уровень связанности компонентов иммунной системы в фазе ремиссии хронического процесса объясняется, по-видимому, тем, что в этой ситуации иммунная система продолжает бороться с чужеродным, поддерживая его на некотором компенсированном уровне, но не может полностью его уничтожить. Спад связанности параметров, часто наблюдаемый при декомпенсации хронического процесса, т.е. при переходе его в фазу обострения, можно объяснить срывом эффективной работы иммунной системы после длительного напряжения в условиях ремиссии. Дальнейшие исследования должны внести окончательную ясность в осознание смысла данного процесса. Однако надо подчеркнуть, что сам феномен является достоверно доказанным. В тяжелых случаях даже острого заболевания, когда оно переходит в декомпенсированную фазу, также наблюдается падение связанности компонентов иммунной системы, зачастую до значений более низких, чем у здорового человека.

Закономерности изменения напряженности работы иммунной системы важны не только теоретически, как следствия общего закона функционирования системы, но и для практики, поскольку синдром напряженности можно выявить практически не только

72

в органах и в очаге воспаления, но и при анализе иммунограмм периферической крови, включающих нагрузочные тесты.

1.3.4.ХАРАКТЕР ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ

ИЗАБОЛЕВАНИЕ

Понятие "нормы" и "патологии" любой функционирующей системы, в том числе иммунной, всегда в определенной степени условно. По-видимому, и нормальное (адекватное), и де-фектное состояния системы лучше проявляются не в спокойном, а в активном ее функционировании. Действительно, иммунная система здоровых людей характеризуется сбалансированным, "спокойным" функционированием всех ее компонентов как единого целого. К этому балансу, который может быть достигнут самыми разнообразными путями, система приходит в онтогенезе. Устойчивый баланс, обеспечивающий эффективность работы иммунной системы в течение всей жизни индивида, может быть достигнут не только при полноценности всех ее компонентов, но и при дефектности отдельных компонентов или звеньев (которые, впрочем, подобно врожденным уродствам, встречаются исключительно редко).

Дефекты иммунной системы проявляются наиболее четко в период ее активной работы. Мы уже подробно писали о том, что свои эффекторные функции иммунная система осущест-вляет посредством организации воспалительной реакции в локальном очаге (воспалительный процесс мы трактуем в широком смысле, с учетом запуска всех продуктивных иммунологических процессов в органах кроветворения и лимфоидных органах). Очевидно, от эффектив-

ности этой реакции зависит успех борьбы с чужеродным, а значит, выздоровление и прежде всего сохранение жизнеспособности организма. Обобщенно можно выделить три основных типа активного функционирования иммунной системы.

Первый тип - это нормальное в своей основе функционирование, которое встречается при подавляющем большинстве заболеваний (острых, хронических,

рецидивирующих и др.). В пределах этого нормального функционирования может (и довольно часто) развиваться недостаточность работы иммунной системы, однако она является проходящей, временной и при устранении соответствующих причин система быстро возвращается в состояние нормальной работы.

Второй тип - патологическое функционирование, связанное с поломками ка- кого-либо специфического звена иммунной системы в реакции на определенный антиген. По сути, ненормальность функционирования иммунной системы в этом случае связана с тем, что специфическое звено неправильно, неадекватно направляет огромный механизм реакции всей массы неспецифических компонентов (хотя сами по себе эти реакции могут идти нормально). Это может проявляться как в бесконтрольном усилении иммунной реакции (аллер-гия) или срыве толерантности к своему антигену (аутоиммунные заболевання), так и в ослаблении отвечаемости на чужое (онкологические заболевания).

Третий тип - патологическое функционирование, связанное с дефектом како- го-либо звена или компонента иммунной системы, когда механизмы компенсации в силу каких-либо причин (например, слишком большого дефекта, неблагоприятных условий жизни и др.), не сработали, система осталась несбалансированной и не может адекватно реагировать на чужеродное. Дефект компонентов может быть врожденным (врожденные иммунодефекты) или приобретенным (болезни кроветворения, связанные со злокачественным перерождением ИКК того или иного типа; СПИД, связанный с избирательным уничтожением вирусом Т-хелперов). Несмотря на интенсивное распространение СПИДа, в сумме все эти патологии состав-ляют абсолютное меньшинство среди других патологических процессов, связанных с работой иммунной системы.

Вопрос о нормальном и патологическом функционировании активированной иммунной системы настолько важен (и в первую очередь для практики) для правильной оценки состояния больного и назначения терапии, что стоит остановиться на нем подробнее.

73

l.3.4.l. ФУHKЦИОHИPOBAHИE ИММУННОЙ СИСТЕМЫ, НОРМАЛЬНОЕ В СВОЕЙ ОСНОВЕ

Впроцессе развития основной иммунной реакции - воспалительной , даже при значительной силе чужеродного, выражающейся в его повышенной инвазивности, токсичности, пролиферативной активности, в очаге воспаления мобилизуются и активируются все иммунные компоненты, но процесс этот отражает обычно нормальную реакцию иммунной системы.

Однако даже при самом эффективном реагировании иммунной системы на чужеродное, при оптимальном соотношении всех ее компонентов на той или иной фазе воспалительного процесса может сработать неадекватно усиленная или заниженная реакция на чужеродный агент - в зависимости от характера инфекта, особенностей пораженной ткани и множества других причин. В то же время интоксикация организма, обусловленная высокой токсичностью продуктовобразуемых инфектом, неправильным питанием, неблагополучием экологической обстановки и другими причинами, а также целый ряд внешних и внутренних факторов, вызывающих истощение резервов организма (таких как дефицит витаминов, алиментарное голодание и др.), могут вызвать существенное угнетение эффекторных и регуляторных клеточных элементов иммунной системы. Неадекватность или недостаточность работы иммунной системы, вызванная этими причинами, на первый взгляд является проявлением "ненормы". На самом деле это лишь кажущаяся патология иммунной системы, не сопро-вождающаяся глубокими нарушениями ее структуры или механизмов. Она является временной, и при ликвидации соответствующих причин система спонтанно достаточно быстро возвращается в состояние своего полноценного функционирования.

Четкое понимание многообразия вариантов нормального функционирования иммунной системы, включающих самопроизвольное возвращение работы системы к норме после возможных сбоев, позволит клиницисту осознанно и правильно подходить к лечению больных.

В этом случае непосредственной задачей лечащего врача является своевременная помощь организму в коррекции воспалительной реакции в случае ее неадекватного течения. Своевременное выявление неадекватности течения воспалительного процесса чрезвычайно сложно и фактически может быть осуществлено лишь в результате творческой работы врача, и здесь каждый добавочный критерий бесценен, поскольку может подтвердить правильность сделанного заключения и, следователъно, стратегию выбранных лечебных мероприятий. Если реакция слишком сильна, ее надо частично погасить, если слишком слаба - усилить, применяя фармакологические или физиотерапевтические средства. Параллельно в каждом конкретном случае необходимо решать вопрос о необходимости фармакологического подавления или механического удаления чужеродного и детоксикации организма от токсических продуктов метаболизма чужеродного. В условиях реакции нормальной иммунной системы, понимая, что все ее силы направлены на подавление чужеродного, врач крайне осторожно должен отнестись к применению в условиях острого процесса иммуномодуляторов, чтобы не сорвать иммунную систему, и так работающую на пределе возможностей, и уж ни в коем случае не доводить этим способом иммунные показатели больного до тех значений, которые бывают у здоровых людей. Таким образом, даже при наличии полноценной иммунной системы с оптимальным реагированием на чужеродное в каждом отдельном акте борьбы с ним в процессе развития воспалительной реакции могут быть элементы, отклоняющиеся от оптимума на данном этапе, но они могут быстро спонтанно исправляться (обычно после устранения причин, их вызывающих). Несмотря на это, необходимо при-

знать, что в подавляющем большинстве случаев реакция иммунной системы на

чужеродное в процессе течения различных заболеваний человека, как правило, является проявлением нормы со всеми возможными нюансами и временными отклонениями от оптимума.

Перед клиницистом всегда стоит вопрос о контроле за ходом развития иммунного эффекторного процесса при любом заболевании. Смысл этого контроля заключается в своевременном выявлении отклонений течения воспалительного процесса от оптимального курса: в обнаружении полного окончания иммунной реакции, которое чаше всего не совпадает с исчезновением клинических проявлений; в выявлении начала реакции на чужеродное, которая начинается до появления клинических симпто-

74

мов, поскольку это даст возможность предвидеть суперинфекцию, воспалительные осложнения и поэтому начать лечебные мероприятия в максимально ранние сроки; в оценке фазы и интенсивности воспалительного процесса. Все это поможет определить

анализ иммунограммы периферической крови.

Следует помнить, что иммунограмма периферической крови может дать перечисленную выше информацию о ходе воспаления лишь я самом общем, "неспецифическом" виде. Рассчитывать в данном случае на более конкретную и специфическую информацию - значит обманывать себя и в конечном итоге пациента. (Заметим, однако, что для решения задачи о воспалении в конкретном очаге более точная информация о динамике иммунных реакций может быть получена непосредственно из ткани очага или участка, находящегося вблизи от очага

воспаления. Однако способы получения и анализа таких местных иммунограмм не входят в задачи настоящей монографии.)

1.3.4.2. ПАТОЛОГИЧЕСКОЕ ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ, ВЫЗВАННОЕ ДЕФЕКТОМ СПЕЦИФИЧЕСКИХ КОМПОНЕНТОВ

ИММУННОЙ СИСТЕМЫ

В ряде случаев отклонения течения воспалительной реакции от оптимального приобретают вид патологической реакции всей иммунной системы. Такие патологии выделены в отдельные группы заболеваний - аутоиммунные, аллергические и онколо-

гические. Действительно, в иммунной системе при неизменности ее общей структу-

ры и отдельных компонентов (как специфических, так и неспецифических) на конкретные антигены или аллергены может возникать извращенная реакция: либо неадекватно усиленная (аллер-гические и аутоиммунные заболевания), либо ослабленная (онкологические заболевания). При этом сама иммунная система бу-

дет осуществлять реакции с нормальными закономерностями и в нормальной последовательности, а патологию реакции будут определять специфические компоненты и механизмы, атипично и неадекватно реагирующие на конкретный антиген. В этих случаях мы можем говорить о патологии реакции иммунной системы именно потому, что данная неадекватность ее реакции на чужеродное является не временной такти-

ческой ошибкой, а постоянной, запрограммированной неадекватной реакцией, с которой организм с трудом и относительно редко может справиться сам, причем за счет элиминации или подавления клонов клеток, ответственных за данный специфический антиген. Иными словами, для успешной борьбы с этими заболеваниями требуется исправление ошибок, заложенных в систему иммунитета природой или индуцированных внешней средой.

Поскольку вся данная группа патологий работы иммунной системы связана со специфической реакцией на какой-либо конкретный антиген, выявление этих патологий должно опираться на специфические иммунные реакции, прежде всего серологические. Их описание можно найти в многочисленных методических руководствах.

Что же касается самой системы иммунитета, то при патологиях данной группы она в основном не изменена, в частности, не изменена ее реакция на подавляющее большинство антигенов (за исключением тех, на которые имеется извращенная реакция). Поэтому динамика сдвигов в иммунограмме при этих заболеваниях будет отражать в полном соответствии со своими закономерностями лишь силу реагирования системы на чужеродное, но никак не будет давать непосредственной информации о данной патологии. Но даже такие иммунограммы могут иметь существенное значение для тактики клинициста при крнкретном заболевании у конкретного больного. Например, при обострении ревматоидного артрита (типичного ауто-иммунного процесса) за счет образования антител и Т-лимфоцитов, специфических к соединительной ткани суставов, начинается воспалительный процесс со всеми своими обычными характеристиками. При этом по сдвигам в иммунограмме можно выявить изменения, характерные для любого воспалительного процесса. Они будут указывать на силу идущего процесса, начало нового обострения или его окончание, что даст возможность правильно назначать лечение. В другом случае, при злокачественных новообразованиях, наличие слабой динамики сдвигов показателей иммунограммы (во всяком случае, на ранних этапах заболевания) - обычное явление, отражающее суть реакции системы при данном заболевании. Появление же после тех или иных воздействий (например, БЦЖ) достаточно резких сдвигов, характеризующих активный воспалительный процесс, является

75

положительным признаком, указывающим на появление развитой реакции организма против чужеродного.

1.3.4.3. ПАТОЛОГИЧЕСКОЕ ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ, ВЫЗВАННОЕ ВРОЖДЕННЫМ ИЛИ ПРИОБРЕТЕННЫМ ДЕФЕКТОМ КОМПОНЕНТОВ ИЛИ ЗВЕНЬЕВ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ

Существует группа заболеваний, связанных с истинной поломкой определенных компонентов или звеньев самой системы иммунитета. Эти нарушения мо-

гут быть связаны как со злокачественным перерождением иммунокомпетентных клеток определенных типов (лейкозы и другие лейкопролиферативные заболевания), так и с нарушением, поломкой в тех или иных звеньях иммунной системы (врожденные - "первичные" или приобретенные - "вторичные" иммунодефекты). Классификацию лейкозов можно найти в любом пособии по клинической гематологии (Кассирский, Алексеев, 1948; Руководство по гематологии, 1979; Клиническая гематология, 1985), первичных иммунодефицитов - в любом издании по клинической иммунологии (Клиническая иммунология, 1986; Иммунологические аспекты инфекционных заболеваний, 1982; Механизмы иммунопатологии, 1983; Петров, 1983; Иммунология, 1987). Классическим примером приобретенного иммунодефицита стало заболевание, широко известное под названием "синдром приобретенного иммунодефицита" (СПИД), при котором от вируса страдают Т-лимфоциты-хелперы. Во всех этих случаях, несомненно, имеется реаль-

ная патология иммунной системы, которая клинически выражается в резком ослаблении сопротивляемости организма чужеродному в атипичности течения иммунных реакций.

Все заболевания этой группы в отличие от заболеваний других типов могут быть четко дифференцированы по резким отклонениям показателей иммунограммы в спокойном периоде (фазе ремиссии). Дефект того или иного звена накладывает на иммунограмму специфический отпечаток не только в спокойном состоянии организма, но и при течении активного воспалительного процесса, обусловливая в большой части случаев атипичность его динамики. Однако, несмотря на эту атипичность, иммунограмма и

вэтих случаях дает возможность следить за ходом воспалительной реакции.

1.3.4.4.ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Вэтой части монографии мы лишь наметили общие контуры работы иммунной системы, стараясь обосновать основные закономерности, лежащие в основе ее функционирования, постоянно проецируя их на сдвиги ИКК, выявляемые в периферической крови. Однако наши знания сегодняшнего дня могут дать лишь эскиз реально функционирующей системы организма. Понимание этого поможет врачу правильно воспользоваться знаниями современной иммунологии для осознанного подхода к интерпретации иммунограммы периферической крови.

Взависимости от многочисленных внешних и внутренних причин целые этапы иммунной реакции в отдельных случаях могут практически не проявляться или же абсолютно доминировать при наличии нормальной иммунной системы. Часть эффек-торных и регуляторных функций из-за сугубо морфологических особенностей органа или ткани может практически не проявляться.

Почти каждая из ИКК имеет, кроме иммунных, ряд параллельных функций, о которых мы часто забываем, изучая иммунную систему организма. Однако существование этих функций, по-видимому, накладывает ощутимые искажения на сдвиги в показателях ИКК периферической крови по сравнению с предсказываемыми теоретически. Исходя из параллелизма и дублирования функций разными компонентами иммунной системы, надо иметь в виду, что, например, уменьшение количества Т-супрессоров приведет к усилению иммунного ответа, только если не увеличится уровень всех других супрессоров (В-, макрофагальных, метаболитических) и при этом не сократится суммарная ак-

76

тивность всех стимулирующих факторов (Т-, В-, макрофагальных и гуморальных хелперов). В ином случае эффекта усиления не только может не быть, но даже возможен обратный эффект.

Во всех звеньях реально существующих взаимодействий компонентов иммунной системы как на уровне регуляции их образования, активации, так и на уровне непосредственного проявления эффекторных функций у нас остается еще слишком много белых пятен для того, чтобы можно было создать реальную рабочую схему количественной работы иммунной системы и на ее основе четко понять сдвиги клеток периферической крови при патологии и точно прогнозировать развитие дальнейших событий в организме.

Основная задача этой теоретической главы состояла в том, чтобы дать клиницисту общие представления о сегодняшних знаниях функционирования отдельных компонентов иммунной системы и об их реальном месте в общей системе, функционирующей как единое целое.

Самой большой ошибкой клиницистов (как, впрочем, и многих теоретиковимму-

нологов), прочитавших данную главу и ознакомившихся с достижениями в теоретических

исследованиях механизмов регуляции, взаимодействий и функционирования отдельных ИКК, будет решение непосредственно применить их для практической интерпретации динамики иммунограммы в клинике, забыв, что сегодня эти закономерности получены в основном в опытах, поставленных в отрыве от целостной реально функционирующей иммунной системы. Ведь теоретические результаты свидетельствуют лишь о возможных механизмах и в основном очень мало о реальной функциональной значимости этих механизмов в реальных ткани или органе, подвергшихся агрессии чужеродного.

И все же мы надеемся, что теоретические основы прикладной иммунологии, описанные в этой главе, помогут читателю более глубоко осмыслить те закономерности сдвигов в иммунограмме, которые выявила большая клиническая практика изучения изменений в иммунограмме при различных патологиях. Возможно, этот теоретический материал хотя бы частично поможет осознать и те имеющиеся ограничения в трактовке иммунограммы, которые необходимо знать при работе с анализом крови в клинике.

2.0.Глава 2

МЕТОДОЛОГИЯ И ТЕХНИКА ЛАБОРАТОРНОГО АНАЛИЗА

Можно с полным основанием утверждать, что становление и развитие важнейшего направления клинической иммунологии - оценки иммунного статуса человека - совпало с появлением и разработкой методов анализа клеток крови и продуктов их функционирования. Это не случайно, поскольку именно кровь является практически единственным легко доступным для исследования материалом, позволяющим судить о состоянии иммунной системы всего организма (секреты и смывы со слизистых поверх-

77

ностей служат основным материалом для оценки местной иммунной системы). Хотя кровь не является ареной непосредственного проявления главных - эффекторных функций иммунокомпетентных клеток (ИКК), она служит основным руслом их транспорта к местам выполнения этих функций. Поэтому анализ клеток крови и их продуктов позволяет судить о состоянии иммунной системы организма

Разработка методов анализа клеток крови проходила в два этапа.

Первый этап начался в конце прошлого века с разработки теорий кроветворения и ретикуло-эндотелиальной системы П. Эрлихом, А.А. Максимовым и др. и завершился работами В. Шиллинга, в которых отобраны простые надежные методы определения основных клеточных показателей крови и даны основы их клинической интерпретации. Огромное практическое значение этого этапа не вызывает сомнений: лейкограмма является важнейшим помощником врача и повседневно используется в клинике.

Второй этап хотя и зародился во времена И.И. Мечникова, но, по сути, начался с клональной теории М.-Ф. Бернета в 50-е годы нашего века. Далее, в 60-70-е годы, последовало интенсивное развитие методологии анализа популяций и функциональной активности лимфоцитов. В эти годы были открыты и развиты основные иммунологические методы: иммунофлюоресценции, бласттрансформации, розеткообразования, торможения миграции лейкоцитов и др. Для завершения этого этапа необходимо широкое внедрение наиболее простых и информативных из данных методов в практику, что в отличие от методов первого этапа возможно только при высокой степени технологичности и автоматизации с использованием стандартных комплектов реактивов, материалов и оборудования.

За рубежом для этой цели созданы высокопроизводительные автоматические приборы, которые вместе с четко отработанной для них технологией и комплектами специальных реактивов разрабатываются и продаются разными фирмами. Эти автоматы и наборы реактивов к ним весьма дорогостоящи. Их использование целесообразно при большом потоке анализов. Дру-гой возможный путь внедрения иммунологических методов состоит в разработке на основе их простых модификаций механизированных технологий, для осуществления которых не требуется дорогостоящих автоматов и реактивов и которые при обеспечении возможности приобретения стандартных комплектов реактивов и материалов могут повсеместно использоваться как для единичных, так

идля серийных анализов.

Внастоящей главе кратко приводится методология иммунологического анализа основных, преимущественно клеточных, компонентов периферической крови, которая должна помочь читателю разобраться во всем многообразии иммунологических методик и их модификаций. Кроме того, подробно описана технология определения комплекса важнейших иммунологических показателей. Описание ее, с одной стороны, поможет желающим внедрить данный компекс в своей лаборатории, даже если эта лаборатория принадлежит обычной больнице или поликлинике, с другой - явится примером, иллюстрирующим фактическую сложность любого, даже самого простого метода, свидетельствующим о том, что использование любого иммунологического метода связано с серьезной кропотливой повседневной работой сотрудников лаборатории.

2.1. ВАЖНЕЙШИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА ЯДРОСОДЕРЖАЩИХ КЛЕТОК КРОВИ

Методы анализа основных типов(популяций) ядросодержащих клеток крови, составляющих лейкограмму, и большинство субпопуляций этих клеток принципиально различаются.

В основе определения лейкоцитов разных типов лежат их морфологические различия по размеру, форме ядра, наличию в цитоплазме гранул и т.д., в связи с чем для их идентификации достаточно подобрать условия, позволяющие выявлять указанные

78

особен-ности более четко (варианты окрашивания, приспособления для распознавания клеток, такие, как микроскоп, гемоцитометр и др.). В противоположность этому субпопуляции лимфоцитов морфологически обычно различаются слабо или не различаются вообще, поэтому их можно определить только в иммунологических реакциях, позволяющих оценивать функциональную активность или выявлять поверхностные структуры (рецепторы или антигены), характерные для данной субпопуляции.

Лимфоциты подразделяют на субпопуляции на основании наличия на поверхности клеток разнообразных маркеров (рецепторов, антигенов) и выполнения клетками определенных функций (эффекторных, регуля-торных). Долгое время считалось, что наличие на клетке того или иного маркера соответствует выполнению ею определенной функции (например, наличие рецептора к эритроцитам барана - Е-рецептора - характеризует Т-лимфоциты, в то время как наличие рецептора к эритроцитам мыши и третьему компоненту комплемента СЗ отличает В-лимфоциты; наличие Fсµ -рецептора и CD 4 антигена отличает Т-хелперы, а Fcγ-рецептора и CD 8 антигена характеризует Т-лимфоциты, обладающие супрессорной и цитотоксической активностью). На самом деле все обстоит значительно сложнее, и это надо хорошо понимать.

Во-первых, было показано, что определенную функцию осуществляет лишь очень небольшое количество лимфоцитов с данным маркером (Mingari, Мorettа, 1982): выполнению клетками данной функции более близко соответствует наличие на них сочетания нескольких мар-

керов (Miedema et al., 1985; Thomas et al., 1982). Более того, функциональная активность кле-

ток в сильной степени зависит от качественного и количественного состава гуморального и клеточного окружения, составляющего среду, в которой клетки находятся: в зависимости от этих факторов функция клеток (например, хелперная) может не только исчезать, но даже частично заменяться другой (например, супрессорной)

(Lehner et al., 1985). Поэтому, говоря о функции клеток лишь на основании того или иного поверхностного маркера, нужно понимать, что эта функция является лишь преимущественной, на самом деле субпопуляция весьма гетерогенна.

Во-вторых, на поверхности каждой клетки находится огромное количество самых разнооб-

разных рецепторов и антигенов (Манько, 1987, 1988; McDonald, 1982; Winchester, Kunkel, 1979),

поэтому разделение популяций по одному маркеру позволяет выявлять лишь субпопуляции, весьма гетерогенные по другим маркерам и выполняемой функции. В то же время раз-

деление клеток на субпопуляции с учетом нескольких маркеров приведет к выявлению фактически бесчисленного количества субпопуляций, которые функционально будут частично дублировать друг друга. Таким образом, учитывая большое разнообразие рецепторов и антигенов на поверхности клеток, а также различие их экспрессии на отдельных клетках, можно прийти к выводу о том, что каждая клетка по своему поверхностному составу индивидуальна, неповторима, а та или иная функция выполняется за счет коллективного действия клеток, которые могут весьма сильно различаться по своей поверхностной структуре.

Втретьих, необходимо учитывать различие в физиологической активности клеток одной

и той же субпопуляции, что проявляется в разной авидности и плотности рецепторов и ан-

тигенов на поверхности клеток (Лебедев, Понякина, 1981). По-видимому, какую-либо функцию выполняют клетки не только с определенным сочетанием поверхностных маркеров, но и с определенной степенью экспрессии каждого из них, т.е. клетки, находящиеся в определенном физиологическом состоянии.

Наконец, ясно, что функции клеток in vivо и in vitro могут существенно различаться

(Mingari, Мorettа, 1982). Поскольку мы определяем функциональную активность клеток, выделенных из крови и очищенных, при помощи специальных тестов (например, продукцию иммуноглобулинов В-клетками в смешанной культуре лимфоцитов или под влиянием митогенов, киллерную активность в цитотоксическом тесте и др.), мы не можем быть полностью уверенными в том, что в организме функциональная активность этих клеток будет аналогичной. Это подтверждается данными о том, что функция клеток каждой субпопуляции сильно зависит от присутствия клеток других субпопуляций (Lehner et al., 1985), их концентрации, наконец, от концентрации лейкоцитов в крови, из которой клетки были выделены (Johnstone et al., 1982).

Каждый иммунолог или врач другой специальности, четко осознав сказанное выше, не должен быть разочарован огромной сложностью рецепторного и антигенного поверхностного состава и вариантов функционирования иммунокомпетентных клеток организма. Напротив, он должен понять, как неограниченны его возможности в поисках того рационального, что не только поможет оценивать состояние иммунной системы пациента, но и сделать новый шаг к осознанию общих и частных закономерностей работы системы защиты организма.

2.1.1. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ПОПУЛЯЦИЙ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ

79

Определение содержания в крови лейкоцитов и количественная оценка основных типов клеток (формула крови, или лейкограмма) осуществляются в практической медицине с ЗО-х годов нашего столетия, когда В. Шиллингом были описаны простые методы определения этих показателей с применением микроскопического исследования. В настоящее время на практике используются несколько способов подсчета количества лейкоцитов и определения лейкограммы, основанных на одном принципе: распознавание образа клеток за счет различия их внешнего вида (Шиллинг, 1931; Кассирский, Алексеев, 1948; Кост, Смирнова, 1964; Козловская, Николаев, 1984).

Внашей стране наиболее распространен способ визуального определения клеток

спомощью микроскопа. Суммарное содержание лейкоцитов в объеме крови определяют путем подсчета количества клеток в известном объеме жидкости, представляющей собою кровь, разбавленную 20-кратным объемом 3%- ного водного раствора уксусной кислоты, разрушающего эритроциты. Технически подсчет клеток в точном объеме осуществляют при помощи камеры Горяева (Кост, Смирнова, 1964; Козловская, Николаев, 1984).

Лейкограмму определяют в мазке, который говорят из капли крови на предметном стекле, и после фиксации окрашивают так, чтобы четко различать основные клеточные структуры (ядро, цитоплазму, гранулы и т.д.), характеризующие клетки отдельных популяций. Клетки всех основных популяций хорошо различаются после окрашивания смесями азура и эозина.

Широкому распространению визуального метода анализа крови способствовала его простота и надежность, хотя низкая производительность, связанная с необходимостью микроскопирования, заставляла искать новые методы.

За рубежом в последние 30 лет появились и сейчас широко распространены высокопроизводительные автоматические приборы для подсчета не только общего количества лейкоцитов, но и формулы клеток. В основе автоматического подсчета лейкоцитарной формулы лежит принцип распознавания образа клетки либо в окрашенном мазке (сравнение морфологических характеристик клеток с образом клеток разных типов, хранящимся в памяти компьютера), либо в цельной крови (по размеру и цитохимическим свойствам клеток после их окрашивания). Подобные автоматы обладают высокой производительностью и точностью. Повышенная точность автоматического подсчета достигается вследствие возможности оценки результата при просчете не 100-200 клеток, как с использованием светового микроскопа, а нескольких тысяч клеток, что позволяет более точно определять количество тех клеток, содержание которых в крови невелико (зозинофилы, базофилы, плазматические клетки).

Следует отметить, что высокая точность анализа в клинике нужна нечасто, в большинстве случаев врача удовлетворяет обычный анализ на 100-200 клеток (Шиллинг, 1931). Во многих случаях на практике бывает достаточно определить в крови, помимо общего количества лейкоцитов, содержание лишь нескольких основных популяций - лимфоцитов, гранулоцитов, моноцитов. Клетки всех этих популяций легко дифференцировать и подсчитывать в процессе определения содержания в крови лейкоцитов, если кровь разбавлять не 3%-ным, а 10%-ным водным раствором уксусной кислоты, который не только лизирует эритроциты, но и способствует набуханию ядер клеток и за счет этогочеткой видимости формы ядер клеток основных популяций. Хотя данный способ дает возможность получать лишь ограниченную лейкограмму, он обладает принципиальной простотой, доступен и требует минимального количества крови.

Поскольку клетки существуют и функционируют в обшей системе крови, лейкограмму целесообразно дополнять показателями, оценивающими свойства цельной крови. Одним из таких показателей является скорость оседания эритроцитов (СОЭ), отражающая реологи-ческие свойства плазмы (связанные, в частности, с содержанием в ней белков). Для определения СОЭ кровь перемешивают с антикоагулянтом (обычно цитратом натрия), помещают в мерный капилляр, выдерживают в течение часа и измеряют столб плазмы над осевшим осадком клеток в миллиметрах (Козловская, Никола-

ев, 1984).

2.1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК

80

Вотличие от методов определения лейкограммы, методы оценки субпопуляций лимфоцитов более сложны, поскольку основаны на проведении иммунологических реакций. Эта сложность обусловливает наличие огромного количества модификаций любого из этих методов, в связи с чем результаты, получаемые разными исследователями, зачастую не совпадают, что, в свою очередь, оказывает влияние на их интерпретацию, а следовательно, снижает клиническую эффективность тестов. Поэтому в настоящее время в широкую практику вошли лишь некоторые из иммунологических методов, а именно те, для которых была отработана несложная, стандартизированная технология.

Среди немногих иммунологических методов, вошедших в медицинскую практику зарубежных стран, можно назвать методы определения субпопуляций ИКК с помощью мембранной иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител, определение содержания иммуноглобулинов - основного продукта В-клеток - методами лазерной нефелометрии и радиальной иммунодиффузии. Другие тесты используются более или менее широко лишь в лабораториях научно-исследовательских медицинских учреждений.

Клеточные реакции определения субпопуляций и функциональной активности ИКК проводят обычно в суспензиях лейкоцитов или их отдельных популяций,

которые выделяют из цельной крови. Большинство реакций (методы иммунофлюоресценции, розеткообразования, фагоцитоза и др.) можно ставить с использованием как суспензий очищенных клеточных популяций, так и суспензий неразделенных лейкоцитов.

Для предотвращения свертывания в кровь при взятии обычно добавляют антикоагулянты: гепарин (20 ед. на 1 мл крови), цитрат натрия (3,8%-ный раствор) или этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА) (5%-ный раствор) (Новикав, Новикова, 1979; Иммунологические методы, 1987).

Все антикоагулянты дозозависимо влияют на реакционную способность клеток (Steel et al., 1974). Гепарин, пожалуй, оказывает на клетки наименьшее влияние, однако присутствие в нем консерванта угнетает активность клеток. Поэтому для этих целей используют гепарин без консерванта. Свертывание крови предотвращает также не менее чем 20-кратное разбавление ее сразу же после взятия, например, физиологическим раствором (Тотолян и др., 1986), а также дефибринирование при помощи вращения в стеклянной посуде в присутствии стеклянных бус.

В настоящее время разработаны и используются разнообразные способы выделения популяций и субпопуляций ядросодержащих клеток крови, основанные на их физических свойствах: 1) различиях удельной массы клеток разных популяций (способы выделения лейкоцитов и их популяций при помощи спонтанной седиментации или в результате центрифугирования с применением градиентов плотности); 2) различиях устойчивости клеток к изменениям осмотического давления среды (методы гемолиза эритроцитов дистиллированной водой или растворами различных веществ); 3) различиях адгеэивной активности клеток (методы адгезии клеток на поверхности пластмассы, нейлоновой вате и т.д.); 4) различиях поверхностного электростатического заряда клеток (методы электрофореза); 5) различиях в физиологических свойствах клеток (методы розеткообразования и фагоцитоза с последующим отделением клеток, вступивших в реакцию, при помощи градиентов плотности или магнита). Большинство из этих способов имеют важное препаративное значение, т.е. позволяют выделять клетки тех или иных популяций и субпопуляций для экспериментального исследования. Для аналитических целей, особенно для методик массового использования, пригодны лишь простые, надежные, наименее трудоемкие методы.

Получение суспензий лейкоцитов. Первая группа способов получения лейкоцитов основана на различиях удельной массы эритроцитов (1,097 кг/л) и лейкоцитов

(1,07-1,08 кг/л).

Одним из наиболее простых является метод спонтанной седиментации эритроцитов. Он состоит в том, что кровь выдерживают при 20-370 С в течение 0,5-1,5 ч, в результате чего она расслаивается: нижний слой содержит преимущественно эритроциты (с примесью лейкоцитов), верхний представляет собой плазму, обогащенную лейкоцитами (однако содержащую большую или меньшую примесь эритроцитов). Плазму отбирают, клетки осаждают центрифугированием.

Для улучшения отделения лейкоцитов от эритроцитов к крови можно добавлять вещества, образующие коллоидные растворы (декстрин, желатин, метилцеллюлозу, фибриноген, гуммиарабик и др.) (Новиков, Новикова, 1979; Линг, 1971). Например, З%-ный раствор желатина в фи-