Лебедев К.А - Иммунология в клинической практике / Лебедев К.А - Иммунология в клинической практике

101

Так, в многочисленных исследованиях было показано, что различные вещества, в частности микробные и тканевые антигены и иммуномодулирующие препараты, могут значительно изменять активность ИКК в различных тестах (розеткообразование, РБТЛ, РТМЛ и др.). В большинстве работ в связи с этим делался вывод о возможности использования этого эффекта для диагностики заболеваний или для выбора лечебного препарата. Клиницисты делали попытки практического применения этих тестов по их указанному назна-чению, ожидая столь же четкого эффекта в клинике, однако в этом их ждало разочарование, что вполне естественно, поскольку действие препарата на ИКК зависит от слишком многих факторов, да и вообще неизвестно, какое именно действие препарата на клетки соответствует определенному эффекту его в организме. А ведь подобного разочарования можно было бы избежать, а от этих тестов получать так необходимую клиницисту помощь, если анализировать данные этих нагрузочных тестов в совокупности с клиническими данными с позиций общей реактивности организма.

Все рассмотренные выше принципы были использованы нами для создания простой и надежной технологии постановки иммунограммы для использования в широкой клинической практике.

2.2 ТЕХНОЛОГИЯ ЛАБОРАТОРНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОМПЛЕКСА ПОКАЗАТЕЛЕЙ КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

(ИММУНОГРАММЫ)

Впредыдущем разделе были перечислены основные показатели клеток крови, которые определяют для оценки иммунного статуса человека в первую очередь ("Показатели первичного иммунологического обследования" (Петров и др., 1984). К ним относятся: содержание в крови лимфоцитов и их субпопуляций: Т-лимфоцитов, Т-хелперов и Т-супрессоров, В-лимфоци-тов; содержание основных продуктов В-лимфоцитов - иммуноглобулинов; фагоцитарная активность нейтрофилов. До настоящего времени определение традиционной лейкограммы и так называемого комплекса показателей первичного иммунологического обследования в лабораториях шло раздельно. Однако, поскольку определение всех этих показателей служит единой цели и весь комплекс показателей должен интерпретироваться как единое целое, экономически целесообразно и определять эти показатели комплексно, в единой технологии. В основу представленной здесь технологии определения данного комплекса, разработанной авторами книги (Понякина и др., 1984; Лебедев и др., 1987, 1988, 1989; Лебедев, Понякина, 1988), положены общепринятые, наиболее простые, дешевые, а значит, и доступные для широкого практического использования визуальные методы определения популяционного состава клеток крови, методы розеткообразования для оценки субпопуляций и методы иммунодиффузии для определения содержания иммуноглобулинов. Затраты труда на постановку данного комплекса тестов минимальны и снижаются пропорционально количеству одновременно проводимых анализов. Важно то, что определение всего комплекса перечисленных показателей (включая возможное расширение его за счет определения адгезивной актквности нейтрофилов и постановки серии нагрузочных тестов) требует минимальных количеств крови - от 0,07 до 0,2 мл (в зависимости от конкретной модификации технологии и широты спектра нагрузочных тестов), что существенно меньше, чем при раздельном определении данных показателей или при использовании других методов. Технология основана на использовании материалов однократного применения и химических реактивов отечественного производства.

2.2.1. ОСНОВНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ

2.2.1.1. ОБОРУДОВАНИЕ

Микроскоп бинокулярный с препаратоводителем любой марки (Биолам Р-16 и др.), снабженный осветителем с диафрагмой (типа ОИ-9М, ОИ-18, ОМ-1 и др.); микроскоп

102

бинокулярныйстереоскопический (МБС-9, МБС-10 и др.); счетчик клеток лабораторный (СЛ-2 и др.); центрифуга с горизонтальным ротором и приставками для центрифугирования планшетов (ОС-6М, ЦЛС-З, ОПН-З, ОПН-8); дозаторы пипеточные на разные объемы; капельницы-дозаторы; часы песочные на 40 с. или секундомер; планшеты для агглютинации с объемом лунок 2 см3, камеры Горяева; пинцеты глазные.

Настройка света по Келлеру для микроскопов с осветителями типа ОИ-18, ОИ-9М и ОМ-1.

Цель настройки микроскопа состоит в том, чтобы добиться такого положения оптики, при котором поток света в виде узкого пучка параллельных лучей идет на объект исследования строго перпендикулярно, не рассеиваясь.

Микроскоп и осветитель фиксируют на крестовине. В микроскопе устанавливают плос-кое зеркало. Из конденсора убирают фильтры; если в нем имеется добавочная собиратель-ная линза, то ее выводят из системы. Исследуемый препарат помещают на предметный столик микроскопа, включают освещение и устанавливают объектив ×20 и окуляры ×7. Затем максимально закрывают диафрагму осветителя. На зеркало микроскопа кладут матовое стекло или лист бумаги и, перемещая лампу осветителя вдоль оси, устанавливают ее таким образом, чтобы на матовом стекле была четко видна спираль лампы. Далее лампу передвигают в центральное положение, что контролируется по выведению светового пятна в центр зеркала микроскопа при помощи боковых винтов втулки патрона (как на осветителе ОИ-18) или сдвигая весь патрон с лампой (как на осветителе ОИ-9М). После этого матовое стекло убирают, диафрагмы осветителя и конденсора полностью открывают и, передвигая макро- и микровинтами, добиваются четкой видимости препарата в окуляре. Диафрагмы осветителя и конденсора вновь закрывают и, поворачивая зеркало микроскопа, устанавливают освещенное пятно в центре поля зрения. Опуская и поднимая конденсор, добиваются максимально четких краев освещенного пятна. Наконец, диафрагмы осветителя и конденсора открывают и при помощи реостата устанавливают оптимальную силу освещения. Если поле освещено неравномерно, лампу поворачивают в патроне на несколько градусов вокруг оси в ту или иную сторону, не изменяя глубины ее положения в патроне. Необходимого увеличения контрастности добиваются, незначительно опуская конденсор. Настройку микроскопа осуществляют каждый раз перед началом работы. При правильно установленном свете для просмотра препарата при объективах ×20 или ×40 обычно достаточен минимальный накал лампы (крайнее левое положение ручки реостата).

Соотнесение центробежного ускорения и числа оборотов ротора центрифуги

Для соотнесения центробежного ускорения и числа оборотов ротора центрифуги используют следующую формулу:

g = 1,1 х N 2 х R х 10 -5

где g - центробежное ускорение; N - число оборотов ротора в 1 мин; R - радиус окружности вращения (расстояние от центра ротора до центра тяжести вращающейся жидкости).

Приставка к горизонтальному ротору центрифуги для центрифугирования 96-луночных планшетов

Если нет готовой приставки, ее можно изготовить самостоятельно. Для этого из листа стали толщиной 2 мм вырезают фигуру соответствующих размеров и формы, края загибают и получают платформу-приставку, величина которой соответствует размерам 96-луночного планшета, с бортиками высотой 1-2 см и боковыми стенками, имеющими отверстие для закрепле-ния на боковинах ротора центрифуги. Готовые приставки попарно уравновешивают (те,которые будут находиться напротив, должны иметь одинаковую массу).

104

Na 2 HPO 4 ·12 Н 2 0 - 1,53 г; глюкоза - 10,0 г; феноловый красный - 0,2 г. остальное - вода дистиллированная.

Для получения раствора Хенкса (однократного) 1 объем 10-кратного концентрата раствора Хенкса смешивают с 9 объемами дистиллированной воды. рН раствора доводят до 7,2-7,4, добавляя по каплям 1%-ный NaOH.

Забуференный физиологический раствор.

Для приготовления 10-кратного концентрата забуференного фосфатами физиологического раствора смешивают 9 частей 1,5 М NaCI и 1 часть 1,5 М фосфатного буфера. 1,5 М NaCI: 87,7 г NaCI в 1 л раствора; 1,5 М фосфатный буфер: 29,6 мл раствора

КН 2 РО 4 (90,73 г/л) смешивают с 70,4 мл раствора Na 2 HPO 4 ·2H 2 0 (118,7 г/л).

Для получения забуференного физиологического раствора (1-кратного концентрата) 1 объем 10-кратного концентрата забуференного физиологического раствора смешивают с 9 объемами дистиллированной воды. Если рН полученного раствора отличается от 7,2-7,4, то его доводят, добавляя по каплям один из растворов, составляющих фосфатный буфер.

Забуференный 10-кратный физиологический раствор с желатином.

4 г кристаллического пищевого желатина смешивают с 96 мл забуференного 10кратного физиологического раствора. Оставляют для набухания желатина на 1-2 ч. Затем нагревают при перемешивании на водяной бане при 70-800 С до полного растворения желатина. Горячий раствор фильтруют. Разливают в стерильные баночки по 5 мл и хранят при +4-100 С. Перед использованием желированный раствор разогревают до комнатной температуры. Раствор желатина может храниться до 1 мес. Даже самое слабое помутнение раствора указывает на развитие в нем микробов. т.е. непригодность для использования.

Раствор Олсвера

Для приготовления раствора Олсвсра на 1 л раствора берут трехзамешенный нитрат натрия - 8,0 г; лимонную кислоту - 0,55 г, NaCI - 4,18 r; глюкозу - 18,66 г, остальное - дистиллированная вода. Если рН готового раствора отличается от 6,4, то его доводят, добавляя по каплям раствор трехзамещенного цитрата натрия или лимонной кислоты.

Фиксатор.

К 86 мл забуференного физиологического раствора (или раствора Хенкса) приливают 12 мл формалина и З мл 25%-ного раствора глутарового альдегида, перемешивают. Хранят в плотно закрытой посуде при 4-120 С до 1 мес.

Раствор теофиллина

Готовят непосредственно перед использованием. Для приго-товления 0,01 М раствора 18 мг кристаллического теофиллина растворяют в 10 мл раствора Хенкса.

Краска метиловый зеленый - пиронин.

Раствор А: смешивают 17,5 мл 5%-ного водного раствора пиронина G, 10 мл 2 %- ного раствора метилового зеленого (если в красителе содержится примесь метилового фиолетового, то его предварительно отмывают хлороформом и сушат на воздухе) и 250 мл дистиллированной воды.

105

Раствор Б: 0,02 М ацетатный буфер (рН 4,8). Для его приготовления 4,61 мл ледяной уксусной кислоты и 16,3 г ацетата натрия смешивают с дистиллированной водой, доводят объем раствора до 1 л.

Растворы А и Б смешивают в равных объемах, добавляют 15% этилового спирта. Готовую краску фильтруют через плотный фильтр. Вновь приготовленную краску перед использованием проверяют.

Краска Романовского-Гимза.

Для приготовления краски смешивают 3 г азура-2 (азур-2состоит из азура-1 и метиленового синего в соотношении 1:1), 0,8 г эозина В (желтого водорастворимого эозина), 251) г глицерина и 250 г метанола. Перед использованием краску спешивают с нейтральной или слабокислой дистиллированной водой (с рН 6,7-7) в соотношении 1:10.

Поскольку часто дистиллированная вода имеет рН менее 6, то для разведения краски лучше использовать буферный раствор, который готовят следующим образом.

Раствор А (рН 8,3): 17,81 г Na 2HPO 2 2Н 2 O в 1 л раствора.

Раствор Б (рН 4,5): 13,64 г КН 2РО 4 в 1 л раствора.

Буфер для разведения краски (рН 6,8); к 1 л дистиллированной воды приливают по 5 мл растворов А и Б.

Раствор канадского или пихтового бальзама.

Готовят насыщенный раствор канадского или пихтового бальзама в ксилоле. Для этого бальзам заливают небольшим количеством ксилола и выдерживают при комнатной температуре 1-2 нед, периодически встряхивая.

Суспензии эритроцитов

Эритроциты барана получают от одного и того же животного. Перед постановкой реакции эритроциты отмывают физиологическим раствором, осаждая каждый раз центрифугированием при 400g в течение 10 мин до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет бесцветной (обычно 2-3 раза). Для приготовления 0,05%-ной суспензии 0,02 мл отмытого плотного осадка эритроцитов смешивают с 10 мл раствора Хенкса, после чего к 2,5 мл полученной суспензии добавляют 7,5 мл раствора Хенкса. Суспензию хранят при 4-120С не более трех часов, перед использованием взбалтывают.

Свежие отмытые эритроциты хранят в растворе Олсвера при 4-120С не более 2 нед. Имеется способ, позволяющий хранить эритроциты без ухудшения их способности к розеткообразованию до 12 мес. Для этого отмытые эритроциты смешивают с раствором Олсвера или физиологическим раствором в соотношении 1:1, к 10 мл полученной смеси добавляют 0,1 мл формалина, перемешивают и хранят при 1- 40С. В этом случае эритроциты отмывают перед использованием физиологическим раствором 5 раз.

Для получения эритроцитов мыши кровь нелинейной мыши берут в пробирку с ге- пари-ном. Отмывают и готовят суспензию таким же способом, что и суспензию эритроцитов барана. Хранят так же, как эритроциты барана.

Суспензия клеток пекарских дрожжей.

Свежие или люфилизированные пекарские дрожжи разводят в физиологическом растворе (соотношение объем/объем 1:1) и выдер-живают на кипящей водяной бане 60 мин. После охлаждения половину надосадочной жидкости сливают и добавляют 10% формалина. Хранят при +4-120 С до 12 мес. Не менее чем за 12 ч до иапользования формалинизированные дрожжи трижды отмывают забуферен-ным физиологическим раствором или раствором Хенкса и оставляют в растворе при 4-120С . Перед использованием дрожжи трижды отмывают (рН надосадочной жидкости после последней отмывки должен составлять 7,2-7,4, т.е. раствор Хенкса не должен менять свой цвет. В противном случае отмывку повторяют). Суспензию клеток дрожжей готовят и используют так же, как суспензию эритроцитов.

106

Пластины, покрытые слоем агара с антисывороткой.

На крышку 96-луночного планшета (размером 9Х12 см), закрепленную по краям винтами на нагревательной подставке из металла (температура 500С ) в строго горизонтальном положении, наливают 16 мл раствора агара, содержащего моноспецифическую антисыворотку к иммуноглобулинам определенного класса. После осаждения на крышке получается ровный слой геля.

Используемые металлические подставки с закрепленными на них крышками для нагревания перед началом работы помещают в термостат с температурой 600С . Вынимают по очереди непосредственно перед заливкой агара.

Раствор агара, содержащий моноспецифическую антисыворотку, готовят следующим образом. Вначале готовят раствор, содержащий 1,5% агара, 2% полиэтиленглико-

ля (М.м. 6000)

(в случае приготовления раствора агара для определения lgM полиэтиленгликоль не добавляют), 0,0001% мертиолата, остальное - физиологический раствор (рН дистиллированной воды, взятой для приготовления физиологического раствора, должен быть не менее 6.8). Агар и полиэтиленгликоль смешивают с физиологическим раствором и нагревают на кипящей водяной бане до полного растворения всех компонентов (обычно в течение 3-4 ч), после чего добавляют мертиолат. Приготовленный коллоидный раствор (в застывшем виде - гель) можно хранить в холодильнике до использования. Готовый раствор агара доводят до температуры 50 0C, после чего к нему приливают моноспецифическую антисыворотку к иммуноглобулинам соответствующего класса в таком количестве, которое рекомендуется в паспорте используемого комплекта антисывороток. Полученный раствор немедленно разливают на пластины (ими могут служить пластмассовые крышки планшетов).

Крышку со слоем агара, содержащего моноспецифическую антисыворотку, охлаждают

до +40C , после чего плотно закрывают аналогичной пустой крышкой, герметизируют при помощи изоляционной полиэтиленовой ленты и хранят при +4- +120 C до использования (в пределах года).

Система "Иммунокап".

При отсутствии коммерческой системы Иммунокап ее можно приготовить самостоятельно (Петров и др., 1987; Лебедев и др., 1988). Приведем вариант системы, отработанный А.А. Тотоляном (Тохтабаев и др., 1987).

Готовят агарозную среду, содержащую 80 мг агарозы, 50 мг полиэтиленгликоля (М. м. 6000), 80 мл веронал-мединалового буфера (рН 8.6), 0,0001% мертиолата и около 1 мл (в зависимости от партии) моноспецифической антисыворотки для определения иммуноглобулинов классов А, М или G. При этом гель для определения lgA подкрашивают красным цветом (добавляя 20 мкг сафранина), для определения lgM - синим (добавляя 10 мкг кумасси голубого), гель для определения lgG оставляют бесцветным. Каждым из трех приготовленных растворов при температуре 50-520C заполняют по одному каналу трехканального капилляра (длиной 3 см), после чего каналы запаивают с обоих концов. Приготовленные таким способом капил-ляры укладывают во флакон, заливают 10-20 % -ным раствором желатина и хранят при О- +40C до 1 года. Из указанного количества агарозной среды может быть получено 300-350 готовых капилляров.

2.2.2.ТЕХНОЛОГИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУНОГРАММЫ

2.2.2.1.ВЗЯТИЕ КРОВИ

Кровь для определенна комплекса иммунологических показателей забирают утром. Кровь берут из 2-4-го пальца любой руки. Подушечку пальца обрабатывают ватным тампоном, смоченным спиртом, затем протирают сухим стерильным ватным тампоном, после чего прокалывают стерильным скарификаторомкопьем однократного

107

применения резким быстрым движением. Первую каплю крови убирают при помощи стерильного тампона. Затем, нажимая на палец, выдавливают следующую каплю, которую и используют для анализа. Кровь не должна растекаться на пальце, она должна быть в виде капли. Кровь для определения содержания лейкоцитов и лейкограммы, оценки показателей клеточного иммунитета и определения уровней иммуноглобулинов обычно набирают раздельно (в этом случае на весь комплекс анализов идет 0,07-0,2 мл крови), но можно набирать одновременно на все тесты в пластмассовую гепаринизированную пробирку объемом 0,5 см 3 (в этом случае необходимо 0,2 - 0,3 мл крови). Мазок крови для подсчета формулы делают вначале.

При взятии крови не следует сильно надавливать на палец, поскольку это способствует выходу вместе с кровью тканевой жидкости. Для облегчения взятия крови руки, если они холодные, лучше разогреть (например, теплой водой) или встряхнуть кисти рук в опущенном положении. Качественный прокол пальца на всю длину копья не только является менее болезненным, но и облегчает взятие крови.

Поскольку кровь, взятая из пальца, начинает свертываться не сразу, а через 1-2 мин, то в тех случаях, когда взятую кровь обрабатывают сразу (например, смешивают с раствором уксусной кислоты или с дистиллированной водой при осуществлении гемолиза), соответствующие капилляры и трубочки нет необходимости обрабатывать антикоагулянтом.

В капилляр кровь поступает самотеком, за счет капиллярной силы, в трубочку ее набирают при помощи медицинской пипетки, надетой на противоположный ее конец.

2.2.2.2.ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ И ФОРМУЛЫ КЛЕТОК КРОВИ (ЛЕЙКОГРАММЫ)

Определение содержания лейкоцитов.

В стерильный стеклянный капилляр набирают 0,008 мл (точно до отметки) крови из пальца (или из пробирки) и быстро переносят в лунку планшета для иммунологических реакций, куда предварительно залито 0,1 мл 10%-ного раствора уксусной кислоты, перемешивают. Кровь сбрасывают из капилляра в лунку при помощи пипетки с переходником, с которой соединяется капилляр. Полученная взвесь может храниться до 4 часов.

Перед просчетом результатов взвесь тщательно перемешивают пипеткой с пластмассовым наконечником и заполняют ею камеру Горяева (следить за тем, чтобы в камеру не попали пузырьки воздуха). Подсчитывают с применением объектива ×20 и окуляра ×7 общее количество лейкоцитов. При указанных условиях одновременно можно подсчитывать и количества лимфоцитов и моноцитов. При подсчете количества клеток в 20 больших квадратах камеры Горяева абсолютное содержание клеток в 1 мкл крови определяют по формулам:

L=K х a1 / 1000,

где L - содержание лейкоцитов в крови (10 9 /л), а 1 - количество лейкоцитов, найденных в 20 больших квадратах камеры Горяева

Л = K х а2 / 1000,

где Л - содержание лимфоцитов в крови, 10 9 /л, а 2 - количество лимфоцитов, найденных в 20 больших квадратах камеры Горяева,

К - коэффициент пересчета; при указанном режиме подсчета в стандартной камере Горяева (имеющей площадь 9 мм 2 и глубину 0.1 мм 2 ) К= 169.

При использовании других режимов подсчета (других объемах раствора уксусной кислоты и крови, другом количестве просчитанных в камере квадратов) формулу пересчета можно вывести из следующей общей формулы:

108

Χ=400 х a х в / 1000 х б,

где Х - содержание исследуемых клеток в крови, 10 9л; а - количество клеток, найденных в определенном числе квадратов; б - количество сосчитанных малых квадратов (в 1 большом квадрате содержится 16 малых); в - разведение крови.

Определение популяционного состава клеток крови в мазке (формулы крови).

Для приготовления мазка необходимо использовать чистые тщательно обезжиренные предметные стекла. Поверхностью предметного стекла (ближе к краю) касаются капли крови, выступившей из пальца (или помещают на него небольшую каплю из пробирки), и тотчас же делают мазок при помощи другого стекла, имеющего шлифованный край, ширина которого должна быть меньше ширины первого стекла. Для этого второе стекло прикладывают к первому под углом 450 и после соприкосновения с каплей и растекания последней по всей ширине шлифа двигают его в направлении свободного конца так, чтобы степень нажатия определя-лась только массой этого шлифованного стекла. Полученный мазок сушат на воздухе, затем на нем пишут графитным карандашом дату обследования и данные пациента. Высушенный мазок фиксируют, выдерживая в метаноле в течение 5-10 мин.

Мазки окрашивают по методу Романовского-Гимза. Способ состоит в том, что на мазок наливают краску, приготовленную так, как описано ранее (краску разводят буфером непосредственно перед окрашиванием). Выдерживают 5 мин, иногда до 20 мин (время подбирают экспериментально), после чего препарат промывают водой и высушивают на воздухе.

Обычно подсчет клеток проводят при иммерсионном увеличении объектива Х90. (При определенном навыке и настройке света в микроскопе по Кеплеру можно считать формулу клеток и при увеличении объектива ×20 и окуляра ×10, что существенно повышает скорость счета без потери качества. В этом случае, конечно, любой мазок с подозрением на присутствие атипичных клеток нужно просматривать при иммерсионном увеличении объектива ×90.)

Подсчет ведут во всем мазке, передвигая его, пытаясь захватить разные поля, зигзагообразно. Следует помнить, что более крупные клетки крови находятся ближе к краю препарата. Клетки различают по величине, форме ядра и окраске. Определяют процентное соотношение клеток разных популяций.

В хорошо приготовленном, правильно зафиксированном и окрашенном мазке клетки имеют следующий вид.

Лимфоциты - округлые клетки диаметром 5-15 мкм. Имеют округлое или овальное хорошо прокрашивающееся (темно-фиолетовое) ядро, окруженное более или менее узким поясом цитоплазмы, окрашивающейся в ярко-голубой или синий цвет.

Моноциты - крупные клетки округлой (реже неправильной) формы размером 12-20 мкм с хорошо выраженной цитоплазмой, окрашивающейся в серо-голубой или дымчатый цвет и имеющей мельчайшую азурофильную зернистость, с большим эксцентрически располо-женным ядром округлой, бобовидной или неправильной формы, которое прокрашивается на столь интенсивно, как ядро лимфоцитов (в светло-фиолетовый или сиреневый цвет).

Нейтрофилы - округлые клетки диаметром 10-15 мкм, имеющие узкое ядро, окрашивающееся в фиолетовый цвет, в виде изогнутой палочки или подковы (палочкоядерные нейтрофилы) или в виде 2-5 сегментов (сегментоядерные нейтрофилы). У сегментоядерных нейтрофилов ядро прокрашивается более интенсивно. Цитоплазма нейтро-

109

филов прокрашивается слабо (обычно она бесцветная либо бледно-розовая, либо бледно-сиреневая из-за очень мелкой зернистости).

Эозинофилы - округлые клетки диаметром 12-17 мкм. Ядро у них более широкое, чем у нейтрофилов, состоит обычно из 2-3 сегментов и окрашивается в фиолетовый цвет. Цитоплазма бесцветна и имеет характерные эозинофильные зерна яркооранжевого или красного цвета.

Базофилы имеют округлую или округло-овальную форму и диаметр 8-12 мкм, ядро неясной структуры, обычно двухили трехлопастное или округлое, которое окрашивается в фиолетоворозовый цвет. Цитоплазма окрашивается в слабо-розовый цвет (обычно более интенсивный, чем у нейтрофилов), но содержит крупные базофильные гранулы, окрашивающиеся в темный фиолетовый цвет.

2.2.2.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОМПЛЕКСА ПОКАЗАТЕЛЕЙ РОЗЕТКООБРАЗОВАНИЯ И ФАГОЦИТОЗА

Получение лейкоцитов.

В стерильную пластмассовую трубочку, которая соединена с медицинской пипеткой, набирают 0,02-0,04 мл крови из пальца (или из ампулы), быстро переносят ее в лунку планшета, содержащую 1,8 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают. Через 40 с осмотическое давление среды восстанавливают, приливая в лунку той же трубочкой 0,2 мл 10-кратного концентрата забуференного физиологического раствора, содержащего 4% желатина, перемешивают. Полученная взвесь клеток может храниться в лунке до 2 часов.

Клетки осаждают центрифугированием при 80-120g в течение 5 мин. Надосадочную жидкость полностью сливают из планшета, осторожно, но быстро переворачивая его вверх дном лунок. К полученному осадку лейкоцитов приливают 0,3 мл раствора Хенкса. В результате получают суспензию лейкоцитов, которую используют для постановки комплекса тестов розеткообразования и фагоцитоза (перед использованием клетки ресуспендируют).

Постановка реакций розеткообразования и фагоцитоза.

Реакции ставят в 96-луночных планшетах доя иммунологических реакций однократного применения, имеющих круглодонные лунки объемом 0,2 мл. Для герметизации в крышку планшета вкладывают полиэтиленовую пленку-прокладку. В процессе постановки реакции крышку закрепляют на планшете при помощи обхвата из тонкой резины. Для работы с суспензиями и растворами пользуются капельницами с объемом капель

0,05 и 0,025 мл.

Различают спонтанное розеткообразование и фагоцитоз (т.е. без дополнительной нагрузки, используют для выявления Т-, В-лимфоцитов, фагоцитарной активности нейтрофилов) и нагрузочные тесты розеткообразования.

Е-розеткообразование (Т-лимфоциты).

В лунку планшета заливают 0,05 мл суспензии лейкоцитов. Приливают 0,05 мл 0,05%-ной суспензии эритроцитов барана. Центрифугируют при 200g в течение 5 мин, затем инкубируют при 8-120С 30 мин.

М-р о з е т к о о б р а з о в а н и е (В-л и м ф о ц и т ы).

Тест М-розеткообразования ставят так же,как тест Е-розеткообразования,но вместо суспензии эритроцитов барана приливают 0,05 мл 0,05%-ной суспензии эритроцитов мыши.

Фагоцитоз нейтрофилов.

110

Тест фагоцитоза ставят так же, как тест Е-розеткообразования, но вместо суспензии эритроцитов барана приливают 0,05 мл 0,05%-ной суспензии фиксированных клеток пекарских дрожжей (вместо дрожжевых клеток можно использовать эритроциты, фиксированные альдегидами, частицы латекса или микробы)

.

Нагрузочные тесты.

Нагрузочный тест Е-розеткообразовання с теофиллином ставят для оценки субпопуляций Т-лимфоцитов, обладающих хелперной (теофиллин-резистентные Т-клетки) и супрессорной (теофиллин-чувствительные Т-клетки) активностью. Для постановки этого теста в лунку планшета заливают 0,05 мл суспензии лейкоцитов, приливают 0,05 мл 0,01 М раствора теофиллина в растворе Хенкса. Инкубируют при 370С в течение 1 часа. Далее приливают 0,05 мл 0,05%-ной суспензии эритроцитов барана и ставят реакцию Е-розеткообразования, как описано выше.

Нагрузочные тесты с другими препаратами (например, антигенами, иммуномодуляторами) ставят аналогично, но инкубируют обычно при 370С в течение 0,5 часа (можно ставить нагрузочные тесты с инкубацией клеток при 370С без препаратов в течение 0,5;1,0; 1,5 часа; можно ставить нагрузочные тесты не только Е-розеткообразования, но также М-розеткообразования и фагоцитоза).

После завершения реакций (т.е. после инкубации осадка при 8 −120С в течение 30 мин) приступают к этапу приготовления препаратов. Для этого в лунки осторожно, так, чтобы не повредить осадок, добавляют 0,025 мл фиксатора, выдерживают при комнатной температуре 10 мин. Надосадочную жидкость удаляют одновременно из всех лунок планшета ин-

тенсивным стряхиванием. Затем в каждую лунку заливают по 0,05 мл раствора краски. Далее к планшету прикладывают лист триацетатцеллюлозной пленки, покрытый слоем дубленого желатина. Сверху накладывают металлическую крышку, к нижней стороне которой (той, которая прикладывается к пленке) приклеен ровный слой поролона толщиной 0,5 см. Крышку плотно прижимают при помощи зажимов. Осадки клеток тщательно ресуспендируют постукиванием планшета вверх и вниз дном лунок. Затем планшет центрифугируют вверх дном лунок при 200g в течение 5-10 мин. После этого планшет переворачивают, жидкость стряхивают обратно в лунки, а пленку осторожно вынимают и быстро высушивают под вентилятором в токе воздуха (лучше теплого). Высушенную пленку немедленно промывают водопроводной водой, промокают фильтровальной бумагой и повторно сушат в токе воздуха в распрямленном состоянии.

На высушенную пленку со стороны препаратов наносят раствор канадского или пихтового бальзама и прижимают к предметному стеклу. Препараты готовы к микроскопированию. На одном стандартном предметном стекле помещается 24 препарата.

Оценка результатов.

В готовых препаратах подсчитывают количество розеткообразующих лимфоцитов и нейтрофилов на 50 соответствующих клеток или количество фагоцитирующих нейтрофилов на 50 нейтрофилов с применением объективов ×20 или ×40 при обязательной настройке света в микроскопе по Кеплеру. За розеткообразующую считают клетку, к которой прикрепилось 3 или большее количество эритроцитов. За фагоцитирующий считают нейтрофил, захвативший 1 или большее количество частиц. Вычисляют % розеткообразующих и фагоцитирующих клеток.

Определение абсолютного содержания клеток в объеме крови проводят по формулам:

где Е-РОЛ - Е-розеткообразующие лимфоциты, соответственно 10 9/л и %; М-РОЛ - М-розеткообразующие лимфоциты, 10 9 /л и %, Л - содержание лимфо-

цитов в крови, 10 9 /л.

Абсолютное содержание остальных розеткообразующих и фагоцитирующих клеток определяют аналогично.