Лебедев К.А - Иммунология в клинической практике / Лебедев К.А - Иммунология в клинической практике

91

тивность естественных киллеров (нормальных киллеров, NK-клеток) оценивают по выделению в культуральную среду радиоактивного изотопа.

Данный метод обладает теми же недостатками, что и метод антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности, поэтому пока широкое использование его в практике мало реально.Ориентировочную количественную оценку естественных киллеров значительно проще можно осуществлять путем изучения морфолцогии клеток (большие гранулярные лимфоциты) или поверхностных маркеров с использованием моноклональных антител.

2.1.3.4. РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ МИГРАЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ (РТМЛ)

РТМЛ основана на феномене подавления миграции лейкоцитов фактором, который выделяют сенсибилизированные лимфоциты при взаимодействии со специфическим антигеном (фактор, ингибирующий миграцию лейкоцитов, МИФ). Данный фактор не является видоспеци-

фичным, поэтому для его выявления можно использовать макрофаги животных (например, морских свинок).

Наиболее распространенный в клинической иммунологии капиллярный вариант РТМЛ (Новиков и др., 1976) состоит в следующем. Капилляры плотно заполняют лейкоцитами крови, вводя в

них суспензию клеток последующим центрифугированием и отламыванием конца, не содержащего осадка клеток. Антигены

(бактерий, вирусов, грибов, тканей и др.) добавляют или к суспензии лейкоцитов, или в среду инкубационных камер. Капилляры помещают в камеры, содержащие среду 199, и инкубируют при 370 С в течение

18-24 ч. За это время лейкоциты мигрируют из капилляра, образуя визуально обнаружимую зону помутнения, "облако". Площадь этой зоны измеряют, проецируя на бумагу. Вычисляют индекс подавления миграции клеток антигеном в сравнении со спонтанной (без антигена) миграцией.

Данный метод позволяет вне организма, не ставя кожных проб, определять сенсибилизацию лимфоцитов человека к различным антигенам и аллергенам. Однако технически метод сложен, требует стерильной работы и относительно большого количества клеток, из-за чего необходимо брать кровь из вены. Получаемые результаты часто нестабильны вследствие нестандартности многих процедур.

2.1.3.5. ФАГОЦИТОЗ

Тест фагоцитоза широко используют для оценки функциональной активности нейтрофилов периферической крови. В качестве объектов фагоцитоза используют живые или убитые клетки микроорганизмов (микробные, дрожжевые клетки), ядросодержащие эритроциты птиц, формалинизированные эритроциты животных, различные твердые частицы - полистирола, латекса, угля, крахмала и др. (Лебедев и др., 1980; Земсков, 1984; Иммунологические методы, 1987; Levinsky et al., 1978; Nikola, 1980; Dunn, 1981).

Использование культур живых клеток микроорганизмов позволяет оценивать не только фагоцитарную, но и киллерную способность фагоцитов.

Наиболее распространенная схема постановки реакции фагоцитоза состоит в том, что лейкоциты, выделенные из периферической крови, смешивают с суспензией частиц, используемых для фагоцитоза, и инкубируют (часто при перемешивании) при 37° в течение 30-60 мин. Затем в фиксированных и окрашенных мазках просчитывают фагоцитарный индекс (% фагоцитирующих клеток) и фагоцитарное число (среднее количество поглощенных частиц на один фагоцит). Скорость фагоцитоза резко увеличивается в результате осаждения смеси клеток и фагоцитирусмых частиц центрифугированием: в этом случае для завершения реакции достаточно 5 мин (Петров и др., 1983). Хотя осуществление реакции фагоцитоза чрезвычайно просто, имеются проблемы, связанные со стабилизацией реакции, поскольку акт фагоцитоза является результатом взаимодействия множества факторов (состояния лейкоцитов и объектов фагоцитоза, малейших изменений состава среды реакции, температуры, количества остаточного белка после выделения клеток, состояния посуды, в которой проводится реакция, и т.д.). Поэтому при постановке реакции необходимо соблюдать предельную точность. При подсчете результатов в тех случаях, когда размер фагоцитируемой частицы составляет менее 1 мкм, возможны затруднения в определении ее локализации: находится она внутри лейкоцита или на его поверхности. Во избежание больших ошибок просчета в этом случае следует использовать иммерсионное увеличение (объектив Х90) либо удалять частицы с поверхности клеток путем обработки их ферментами (например, трипсином). При использовании более крупных частиц (например, клеток дрожжей или эритроцитов) подобных затруднений не возникает. Широкое внедрение реакции фагоцитоза в практику клиниче-

92

ской иммунологии зависит в значительной степени от создания стабильных и стандартных частиц для фагоцитоза.

2.1.3.6. ТЕСТ ВОССТАНОВЛЕНИЯ НИТРОСИНЕГО ТЕТРАЗОЛИЯ ( НСТ-ТЕСТ )

Данный тест характеризует окислительно-восстановительный потенциал нейтрофилов, являющийся одним из важных показателей их фагоцитарной активности. НСТтест основан на пиноцитозе нейтрофилами раствора нитросинего тетразолия (НСТ) и накоплении его в фагоцитарных вакуолях с последующим восстановлением и превращением растворимого бесцветного НСТ в нерастворимый темно-синий формазан, который легко идентифицировать в ейтрофилах визуально.

Постановку метода осуществляют обычно в цельной крови (Нагоев, Шубич, 1981). Каплю крови смешивают на предметном стекле с раствором нитросинего тетразолия, инкубируют при 37°С 30 мин. Затем в предварительно окрашенном мазке просчитывают количество нейтрофилов, содержащих гранулы формазана.

Технически метод достаточно прост, однако требует использования высокоочищенного свежего хорошо растворимого нитросинего тетразолия. Hepacтворимый НСТ, выпавший в осадок, для реакции полностью не годится, поскольку в этом случае наблюдается обычный фагоцитоз частиц.

2.1.4. НАГРУЗОЧНЫЕ ТЕСТЫ

Имеются два основных типа тестов, применяющихся для оценки популяций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток: определение поверхностных маркеров на клетках и определение функциональной активности клеток, присущей той или иной субпопуляции. Вместе с тем и экспрессия поверхностных маркеров, и функциональная активность, по сути, отражают физиологическую активность клетки, т.е. состояние клетки, определяемое ее возрастом, окружением, ретроспективным функционированием и другими причинами, которое обуслов-ливает эффективность выполнения клеткой свойственной ей функции при наличии соответствующей потребности всей системы.

Методы определения поверхностных маркеров позволяют, в сущности, оценивать не только фенотип клетки, но н ее физиологическую активность. Физиологическая активность клетки (ее поверхностный рецепторный и антигенный состав и степень функциональной активности) обусловлена, с одной стороны, этапом дифференцировки клетки, с другой - ее активацией, которая зависит от потребностей всей системы, в которой клетка существует, т.е. ее окружения.

Выявление поверхностных рецепторов или антигенов при помощи различных реакций сильно зависит от состава среды, в которой проводится реакция (рН, наличие ионов Са 2+ и Mg 2+, поли-

катионов и полианионов и др.) (Bach, 1973; Steel et al., 1974).

Различные воздействия на клетки могут существенно изменять обнаружение рецепторов. Так, инкубация клеток с аутологичной или эмбриональной телячьей сывороткой, метогенами, нейраминидазой существенно увеличивает розеткообразование клеток с эритроцитами барана, мыши, человека, различных животных (Steel et al., 1974; You, 1975). Преинкубация клеток с сывороткой, нейраминидазой, трипсином, а также гипотонический шок дистиллированной водой приводят к существенному увеличению обнаружения клеток с Fс-рецепторами, по-видимому, из-за снятия блокирующих их веществ (Haegert, 1977; Moretta et al., 1977). Инкубация клеток с различными веществами приводила и к изменению количества моноклональных антител, присоединяемых к клеткам (Лебедев и др., 1987; Joffe et al., 1983). Все это свидетельствует о вариабельности экспрессии поверхностных маркеров клеток в зависимости от их физиологического состояния.

Следует отметить, что поверхностные рецепторы на клетках неравноценны, они существенно различаются по авидности. Поэтому их выявление сильно зависит от качества используемых индикаторных частиц и чувствительности используемого метода. Так, обработка эритроцитов барана нейраминидазой, папаином, бромидом 2-аминоэтилизотиомочевины, а эритроцитов мыши - нейраминидазой или проназой существенно повышает розеткообразование (You, 1975; Potter, Мооге, 1978). Использование методов непрямого иммуноглобулинового розеткообразования или непрямой иммунофлюоресценции в отличие от прямых модификаций тестов позволяет выявлять поверхностные иммуноглобулины не только на В-клетках, но и на нулевых и даже Т-лимфоцитах

(Лебедев, Рыжова, 1969; Haegert, Coombs, 1976).

Итак, выявление на поверхности клеток рецепторов или антигенов зависит от многих причин, в частности, от чувствительности метода, состава среды реакции, исходного состояния клеток, с

93

которыми проводится реакция. Оптимизация условий проведения реакций и активация клеток позволяют существенно увеличить обнаружение на клетках тех или иных маркеров. Следовательно, рецепторы и антигены распреде-лены на клетках крайне неравномерно и их выявление в большой степени является не качественной характеристикой клетки (есть - нет), а количественной (больше - меньше).

Каждый исполыуемый метод выявляет рецепторы или антигены в том случае, если их количество выше определенного порога, составляющего предел чувствительности данного метода, и факт их невыявления вовсе не говорит о том, что их нет вообще. Кроме того, часть рецепторов или антигенных детерминант могут быть блокированы, у части активные центры могут быть скрыты, и обнаружить подобные маркеры возможно лишь при определенных изменениях условий постановки реакций или определенным воздействием на клетки, приводящим к их активизации.

Клетки, выделенные из организма, имеют вполне определенную физиологическую активность, которая зависит от множества факторов (клеточное и гуморальное окружение, возраст, биологические ритмы, гормональный цикл, уровень стресса, наличие инфекционных, регенеративных и других процессов и т.д.), а в целом отражает общее состояние организма. Определение иммунологических показателей (как поверхностных маркеров, так и показателей функциональной активности) связано с приведением клеток в контакт с химическими веществами (обычно природного происхождения) или частицами при определенных условиях, т.е. с определенным воздействием (нагрузкой) на клетки. Получаемый при этом результат зависит не только от физиологической активности клеток, но и от условий постановки метода, а по сути от дозы и качества нагрузки. Условия постановки метода можно подобрать таким образом, чтобы он выявлял преимущественно те или иные популяции или субпопуляции ИКК либо клетки, обладающие

вданной популяции определенным уровнем функциональной актив-ности. Это позволяет у разных людей констатировать снижение или повышение количества клеток указанных типов. Однако для оценки физиологической активности клеток этого недостаточно, поскольку, как было сказано выше, результат теста сильно зависит от условий его постановки. Очевидно, исходную физиологическую активность клеток можно оценить, осуществляя несколько постановок теста (несколько измерений) в разных условиях.

Впроцессе развития методов клинической иммунологии определилась важность осуществления клеточных методов в нескольких вариантах их постановки. Эти методы по аналогии с клиническими были названы "нагрузочными тестами" (Понякина, 1984; Лебедев и др., 1987). В широком смысле под нагрузочными тестами понимаются такие, которые ставятся в несколь-ких разных вариантах (при разной нагрузке на клетки) с целью сравнения полученных результатов. Это позволяет оценить физиологическую активность клеток.

Мы выделили понятие нагрузочных тестов для того, чтобы помочь читателю четко осознать их важность и осознанно применять в научной и практической работе. Обычно

виммунологической литературе эти тесты не выделяются, хотя являются основой получения полезных результатов одними методами и часто исполыуются при осуществлении других методов.

Тесты, основанные на изменении одного или нескольких параметров. Эти тесты вхо-

дят в основу постановки реакций бласттрансформациии и определения цитотоксической активности, они часто используются в розеткообразовании.

При постановке реакции бласттрансформации используют обычно разные (2-5 доз) концентрации митогенов или антигенов либо разное время культивирования клеток. Это дает возможность не только оценивать возможности вступления клеток в пролиферацию, но и определять активность клеток в реакции.

Определение цитотоксической активности лимфоцитов проводят также, как правило, при различном соотношении клеток-эффекторов и клеток-мишеней (обычно в 3-6 разных соотношениях). Это дает возможность, с одной стороны, выявить максимальный уровень цитотоксичности, с другой - дополнительно получить характеристику физиологической активности клеток.

При определении количества розеткообразующих клеток часто не ограничиваются постановкой теста в оптимальных условиях, наиболее полно выявляющих субпопуляции. Дополнительно определяют еще "активные" розетки (образуются при четко определенном соотношении количеств эритроцитов и лимфоцитов, которое в несколько раз ниже, чем достаточно доя насыщения реакции, и без инкубации после центрифугирования) (You, 1975: Semenzato et al., 1981), высокоаффинные розетки (получают при соотношении количеств эритроцитов и лимфоцитов, равном 25, и инкубации реакционной смеси при 290С ) (West et al., 1978), стабильные (образуются при 370С ), а иногда - гравитационные (образуются при спонтанной седиментации клеток, т.е. без

94

центрифугирования, в течение 1 ч) (Наn et аl., 1979). Постановка таких дополнительных тестов дает возможность оценки физиологической активности клеток, однако весьма трудоемка (например, определение активных и высокоаффинных розеток требует подбора четкого соотношения клеток и индикаторных частиц).

Использование клеточных тестов в качестве модели для испытания сыворотки крови и других гуморальных факторов. Наиболее простые клеточные тесты используют в качестве моделей для изучения свойств (стимулирующих, супрессирующих, опсонизирующих) сыворотки крови, различных секретов, а также их отдельных факторов. В качестве таких моделей наиболее часто используют методы розеткообразования (Bach, 1973) и фагоцитоза, преимущественно с крупными частицами, такими, как дрожжевые клетки и эритроциты (Лебедев и др., 1980; Levinsky et al., 1978).

При постановке таких тестов обычно используют клетки, выделенные из крови здоровых доноров, на которые перед постановкой реакции или в процессе ее действуют изучаемыми сыворотками. По направленности изменения показателя розеткообразования или фагоцитоза (в сравнении с контролем) констатируют наличие стимулирующей или супрессивной активности, изучают опсонизирующую активность (в случае фагоцитоза). При использовании этих тестов следует помнить, что конечный результат, в частности направление изменений в сравнении с контролем, зависит не только от свойств и концентрации сыворотки, но и от исходного физиологического состояния клеток, поэтому для получения объективных данных такие тесты нужно проводить с одной партией клеток и индикаторных частиц, которые должны храниться, например, в замороженном состоянии. Эти тесты просты и доступны, поэтому пригодны для широкого использования в практике.

Определение чувствительности клеток к антигенам. Эти тесты получили весьма широ-

кое распространение в клинической иммунологии. Наиболее часто чувствительность клеток к антигенам оценивают по изменению их активности в тестах розеткообразования и реакции торможения миграции лейкоцитов. Тесты ставят как с микробными, так и с тканевыми антигенами.

Обычно от этих тестов (по аналогии с кожными пробами) ждут помощи в диагностике заболеваний, поскольку снижение или повышение активности клеток в реакциях после воздействия на них антигенами обычно расценивают как наличие сенсибилизации к ним клеток. Однако на самом деле все значительно сложнее, поскольку физиологическая активность клеток в отношении антигенов зависит от слишком многих причин, в том числе от общего состояния организма, стадии и фазы заболевания и т.д. Огромное значение для этих тестов имеет степень очистки и подбор дозы антигена. Однако, несмотря на указанные трудности, эти тесты при правильном их использовании и трактовке могут принести в клинике определенную пользу.

Тесты роветкообразования с антигенами осуществляют следующим образом (Лебедев и др., 1981; Offner et al., 1980; Ramey et al., 1980). Выделенные клетки инкубируют с антигенами (обыч-

но в пределах одного часа; антиген берут в двух-трех разведениях), после чего ставят с ними реакцию розеткообразования, наиболее часто с эритроцитами барана. Параллельно проводят контрольный опыт без антигена, с которым сравнивают полученный результат.

РТМЛ используют главным образом для определения чувствительности клеток к антигенам и аллергенам. Индекс подавления (а зачастую и стимуляции) миграции клеток антигеном или аллергеном вычисляют в сравнении с контролем.

Нагрузочные тесты с лекарственными и другими веществами. Выше мы рассмотрели наиболее распространенные иммунологические тесты, которые при условии проведения их в дополнительных вариантах в измененном режиме или в присутствии дополнительных компонентов можно считать нагрузочными. Наиболее четко использование нагрузки отражает следующая схема постановки нагрузочного теста:

По сути, нагрузочные тесты предполагают получение и анализ не одного показателя, а обязательно комплекса показателей (не менее двух: при нулевом и каком-либо определенном, дозированном воздействии). В качестве такого дозированного воздействия обычно применяют инкубацию кле-

ток в течение определенного времени с определенными количествами препаратов или без них. При этом используют небольшие, физиологические дозы препаратов или других воздействий, поскольку большие дозы могут быть для клеток токсичными, что приведет к получению неадекватных результатов.

По указанной схеме можно ставить нагрузочные тесты розеткообразования, иммунофлюоресценции, фагоцитоза, НСТ, РБТЛ и др. Наиболее часто подобные тесты ставят с лекарственными препаратами, в частности иммунокорригирующими (левамизол, диуцифон, препараты тимуса и др.), для того чтобы, определив действие препарата на клетки, прогнозировать эффективность его применения при лечении (Лебедев и др., 1980; Успенский, Ващенков, 1984). Однако вопросы прогнозирования не столь просты, как казалось авторам первых работ, поскольку реакция

95

клеток на препарат в целостном организме и вне его неравнозначна. Выяснению же вопроса о том, какая именно реакция клеток на препарат соответствует желаемому эффекту, должна предшествовать большая исследовательская работа (Петрухин и др., 1986). Вместе с тем уже сегодня ясно, сколь большой вклад могут внести нагрузочные тесты в оценку иммунного статуса человека (Лебедев и др., 1987), требуя при этом лишь минимальных дополнительных затрат.

В розеткообразовании, например, наиболее часто используются следующие нагрузочные тесты:

1) инкубация клеток при 370С в течение 0,5-2 ч; 2) инкубация клеток в течение того же времени с растворами различных препаратов в концентрациях, близких к физиологическим, например с левамизалом, теофиллином, Т-активином, другими иммунокорригирующими препаратами; 3) инкубация клеток с различными дозами этих же препаратов. Практическое значение этих тестов будет показано ниже. Отметим лишь, что нагрузочный тест с теофиллином приобрел особую популярность как наиболее простой способ оценки функциональных субпопуляций лимфоцитов, поскольку инкубация с этим препаратом приводит к подавлению розеткообразования преимущественно клеток, обладающих супрессорной активностью, мало влияя на клетки с хелперной актив-

ностью (Ярилин, 1985, Limatibul et al., 1978).

2.1.5.ВОЗМОЖНОСТИ И ОГРАНИЧЕНИЯ ПРИМЕНЕНИЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В КЛИНИКЕ

Впредыдущих разделах мы кратко остановились на иммунологических методах анализа клеток крови лишь в тех рамках, в каких это необходимо для общего понимания методической основы клинической иммунологии. И при общем знакомстве с методами, и при освоении их, а также при повседневной работе с ними у исследователя и практика неизбежно возникают вопросы, разрешение которых очень важно для успеха всей работы.

Вопрос 1. Что можно и чего нельзя ожидать от иммунологических методов анализа крови?

Сначала напомним, что сам объект исследования имеет определенные особенности. Находясь в крови, ИКК, как правило, не выполняют свойственных им иммунологических эффекторных функций: они пребывают там обычно весьма короткое время, необходимое для транспортировки в органы, ткани и очаг воспаления. В каждый период времени в крови находится

лишь очень небольшое количество ИКК организма (например, менее 0,5% всех имеющихся в организме лимфоцитов (Иммунологические методы, 1987). Поэтому анализ ИКК крови может дать представление лишь об общем физиологическом состоянии иммунной системы в данный момент времени, а не о прямом их функционировании. В организме ИКК существуют и функционируют не как разобщенные самостоятельные популяции, а как сбалансированное единое целое - иммунная система.

Тесное взаимодействие компонентов иммунной системы происходит на всех этапах их существования: на уровне формирования клеток, их активации, выполнения эффекторной функции и т.д. И хотя в теоретическом разделе мы пытались как можно более четко охарактеризовать отдельные популяции и субпопуляции ИКК, определенные элементы их сопряженности, необходимо еще раз подчеркнуть, что сегодня мы знаем лишь очень небольшое количество механизмов функционирования элементов иммунной системы как в отдельности, так и в их целостности, и тем более многие из них неясны в своем количественном проявлении. Даже такие, казалось бы, ясные механизмы, как выполнение Т-лимфоцитами супрессорной и хелперной функций, не являются однозначными: различие в количестве носителей той или иной функции может приводить к появлению противоположного эффекта. Более того, поскольку указанными регуляторными функциями могут обладать не только Т-лимфоциты, но и другие клетки, например В-лимфоциты и макрофаги, ясно, что в целостном организме они действуют в комплексе, суммируясь в определенный конечный эффект. Сделать вывод о характере этого конечного эффекта по данным о некоторых известных элементах, входящих в эту сумму, практически невозможно из-за огромной сложности системных взаимодействий.

На все разнообразие неспецифических системных взаимоотношений компонентов в организме накладывается элемент специфики, который зависит от количества и качества антигенной нагрузки. Этот элемент также может принципиально изменять активность клеток, примером чего является специфическая опсонизация, сильно влияющая на фагоцитоз.

96

В целом конечный эффект той или иной функции ИКК зависит от системных взаимодействий специфических и неспецифических компонентов.

Оценить системные механизмы на основании изучения отдельных параметров очень сложно, а сегодня практически невозможно. Однако для практики важно знать, что каждый иммунный показатель благодаря системным взаимодействиям несет в себе информацию об интегральном воздействии на него как клеточных и гуморальных факторов самого организма, так и чужеродного, поэтому его определение вполне может служить для оценки общей иммунологической реакции организма (и крайне редко, в основном в случае полного отсутствия компонента, - о наличии иммунодефицита).

Наконец, для иммунологического анализа мы используем клетки, выделенные из организма, т.е. помещенные принципиально в иные условия существования. Поэтому, анализируя клетку любым методом, мы определяем физиологическое состояние выделенной клетки, которое, возможно, имеет весьма мало общего с ее реальной физиологической активностью в организме. Однако для практических целей знать истинную активность клетки в организме не столь важно, если она так или иначе отражается в состоянии выделенных клеток : для решения многих задач вполне достаточно иметь подобные косвенные данные.

Вопрос 2. Какие методические приемы и методы предпочесть для адекватной оценки иммунологических показателей?

Перед исследователем, разрабатывающим метод, всегда стоит проблема, до какой степени очищать тестируемые клетки. На первый взгляд может показаться, что это дело вкуса методиста, однако на самом деле этот вопрос является принципиальным. Для того чтобы на него ответить, вспомним, что для интерпретации получаемых данных важно то, что каждый компонент, функционируя в целостной системе организма, несет в себе информацию об интегральном воздействии на него компонентов этой системы. По мере углубления очистки клеток эта информация уменьшается и ее заменяет другая, связанная с особенностью используемых методов и длительностью обработки.

Из этого следует, что настоятельные предложения и попытки некоторых исследователей использовать в лабораторных реакциях "чистые" популяции ИКК неправомерны по следующим причинам.

Во-первых, каждая добавочная манипуляция по очистке клеток связана с созданием дополнительных нефизиологических условий и увеличением длительности процесса, что с каждым этапом все более изменяет физиологическое состояние выделенных клеток по сравнению с их состоянием в организме.

Во-вторых, многие функциональные тесты в суспензиях высокоочищенных клеток практически не идут, что заставляет вводить в них клетки других популяций в произвольных количествах и таким образом создавать искусственную ситуацию, еще более отдаляясь от системы целостного организма. Например, реакция бласттрансформации Т-лимфоцитов в отсутствие макрофагов почти не идет. Поэтому на практике лимфоциты выделяют для этой реакции так, чтобы оставалось небольшое количество макрофагов, и таким образом создают искусственно для клеток новую систему. Проведение этой реакции в суспензии лейкоцитов цельной крови существенно приблизит условия реакции к реальным условиям в организме.

Втретьих, высокая степень очистки может заставить клетки вести себя совершенно нехарактерным образом по сравнению с их поведением в целостном организме. Так, например, облучение животных приводило к резкому подавлению фагоцитарной функции в организме (Фриденштейн, 1958), в то время как очищенные фагоциты в высокой степени радиорезистентны (Чахава, 1972).

Таким образом, высокая степень очистки ИКК слишком далеко уводит от реальной ситуации в организме.

Из этого следует, что для проведения иммунологических реакций необходимо для клеток избирать условия, наиболее близкие к реальным, имеющимся в организме. В частности, при невозможности использования цельной крови лучше применять суспензию суммарных лейкоцитов, выделенных из цельной крови. Не случайно в настоящее время все более широкое распространение получают именно эти методы (для постановки РБТЛ, НСТ-теста, метода иммунофлюоресценции с моноклональными антителами используют цельную кровь, для поста-новки РТМЛ и розеткообразования используют суспензию нефракционированных лейкочитов цельной крови и т.д.).

97

Как указывалось выше, большинство иммунологических реакций позвяляет оценивать физиологическую активность клеток лишь при определении комплекта показателей в нагрузочных тестах. Для определения адекватной реакции клеток выбираемые нагрузки должны быть физиологическими.

Критерием физиологичности нагрузки может быть разнонаправленное ее действие на клетки разных образцов крови, поскольку постоянное однонаправленное действие, например подавление, может свидетельствовать о токсичности используемого вещества или неблагоприятности режима постановки теста. Даже в РТМЛ антигены при правильном подборе их концентрации могут не только тормо-

зить, но и стимулировать миграцию, и это неудивительно, поскольку феномен миграции лейкоцитов обусловлен выделением лимфоцитами фактора торможения миграции лейкоцитов, а направленность действия этого фактора (тормозящее или стимулирующее) зависит от его концентрации и ряда других причин, например уровня физиологической активности нейтрофилов, причем действие всех этих причин является комплексным.

Все клеточные иммунологические методы основаны на определении тех или иных физиологических характеристик клеток, которые позволяют относить клетки к определенным субпопуляциям или определять их функциональную активность. Поскольку активность самих клеток постоянно меняется (как в организме, так и вне его), то все методы позволяют оце-

нивать субпопуляции лишь с тем или иным физиологически обусловленным уровнем точности.

Рассмотрим конкретный вопрос: какой метод анализа Т-супрессоров и Т-хелперов лучше применять в клинике - иммунофлюоресцентный с использованием моноклональных антител (для обнаружения клеток с дифференцировочными антигенами CD 4 и CD 8), розеткообразования для

определения клеток с Fcµ и Fc y -рецепторами или же нагрузочный тест розеткообразования с теофиллином.

Заметим сразу, что первые два метода, особенно первый, более точно выявляют клетки с указанными маркерами, в то время как тест с теофиллином позволяет лишь косвенно судить о них по изменению физиологической активности клеток после инкубации с препаратом. В ряде работ показано, что данные, получаемые с помощью каждого из указанных методов, в той или иной степени коррелируют между собой (Ярилин, 1985; Петров и др., 1986; Limatibul et al., 1978; Mingari, Moretta, 1982). В то же время, как было показано выше, ни один из указанных тестов не дает возможности выявить истинное количество хелперов и супрессоров в крови (Лебедев, Понякина, 1985; Mingari, Moretta, 1982). Более того, даже если бы мы смогли определить истинное содержание в крови клеток рогуляторных субпопуляций, оно ничего не скажет нам о действительном хелперном или супрессорном эффекте в организме, ибо, с одной стороны, их функциональная активность крайне гетерогенна, с другой - эффект складывается из системных взаимоотношений регуляторных субпопуляций не только Т-лимфоцитов, но и В-клеток и макрофагов, сывороточных регуляторных компонентов и множества других факторов.

Таким образом, для анализа субпопуляций можно использовать любой из указанных

методов, нужно только правильно трактовать его результаты, учитывая точность метода и физиологические характеристики клеток, определяемых данным методом. При выборе метода оценки той или иной характеристики ИКК надо исходить из реальных возможностей и при этом никогда не переоценивать значимости метода, четко знать его ограничения, в противном случае нас всегда ждет разочарование при его применении в клинике. При работе с любым методом желательно определять не один показатель, а серию показателей в нескольких нагрузочных тестах, что позволит более полно реализовать возможности метода в оценке физиологического состояния клеток.

Вопрос 3. Какие методы оценки иммунного статуса следует внедрять в клинику в первую очередь?

Свыше чем 20-летний опыт разностороннего иммунологического обследования больных позволил выделить комплекс иммунологических показателей, имеющих в дополнение к лейкограмме первостепенное значение для оценки иммунного статуса пациента (Механизмы иммунопатологии, 1983; Иммунологические аспекты инфекционных заболеваний, 1982; Петров и соавт., 1984). Этот комплекс включает определение в периферической крови следующих показателей: содержания Т- и В-лимфоцитов, субпопуляций Т-лимфоцитов, обладающих хеллерной и супрессорной активностью, фагоцитарной активности нейтрофилов, содержания иммуноглобулинов (классов А, М, G). Ог-

98

ромную диагностическую важность представляют нагрузочные тесты (Лебедев и др., 1987).

Для определения субпопуляций лимфоцитов практически наиболее пригодны два метода: метод цитофлюориметрии с моноклональными антителами и метод розеткообразования. Метод цитофлюориметрии хорош по всем показателям, однако требует использования дорогостоящих, а зачастую пока и мало доступных реактивов и оборудования. Он может использоваться в крупных диагностических центрах, где имеется большой постоянный поток исследований и использование автоматов становится экономически оправданным. Метод розеткообразования удовлетворяет всем перечисленным выше требованиям при условии надежной технологии его постановки и создания дешевых коммерческих комплектов материалов и реактивов. Особенно важно то, что он позволяет определять сколько угодно широкий комплекс показателей в нагрузочных тестах.

Методы определения фагоцитарной активности нейтрофилов различаются в основном по виду частиц, используемых для проведения реакции. Для широкого практического использования не годятся культуры живых клеток (микробных или дрожжевых). Следует использовать крупные частицы, дающие при длительном их хранении стабильные результаты.

Всем перечисленным выше требованиям определения содержания иммуноглобулинов удовлетворяют методы иммунодиффузии (как радиальной, так и линейной). Методы лазерной нефелометрии, радиоиммунный, иммуноферментный предъявляют особые требования к реактивам, для учета их результатов необходимы более или менее сложные приборы. Поэтому в настоящее время они могут использоваться только в крупных специализированных диагностических лабораториях.

Все указанные методы могут быть использованы для оценки иммунологических показателей уже в настоящее время. В перспективе методы определения этих показателей, конечно, должны совершенствоваться, и после создания максимально простых, дешевых и стандартизированных технологий они могут заменять и дополнять данные методы в широкой практике. Прогрессивной, по-видимому, явится разработка простых невизуальных способов определения расширенной лейкограммы, автоматизированных стабильных методов определения иммуноглобулинов на основе иммуноферментного анализа, принципиально иных, более простых и надежных способов оценки субпопуляций ИКК и определения интегральных показателей нагрузочных тестов in vitro.

Вопрос 4 . Каким критериям должен удовлетворять метод, применяемый в практической клинической иммунологии?

Основными критериями любого метода являются чувствительность, точность, надежность. Определим в отношении методов клинической иммунологии каждый из них.

Чувствительность. С созданием новых иммунологических методов обычно возникают мно-

гочисленные способы повышения их чувствительности. С одной стороны, эффективность этих способов может быть очень высокой, поскольку, как мы отмечали выше, распределение

на клетках рецепторов и антигенов, а также функциональные характеристики, определяющие в совокупности физиологическую активность клеток, имеют градиентный характер, т.е. являются преимущественно не качественной, а количественной характеристикой. С другой стороны, увеличение чувствительности метода может быть полезно отнюдь не всегда, поскольку в этом случае зачастую исчезает возможность дифференциации физиологической активности клеток. Увеличение чувствительности метода может приводить и к парадоксальной на первый взгляд ситуации снижения чувствительности к изменению физиологического состояния клетки под влиянием нагрузочных факторов или в зависимости от состояния организма.

В качестве примера разберем ситуацию с выявлением нулевых лимфоцитов.Нулевые клетки (ни Т-, ни В-лимфоциты) определены как лимфоциты, имеющие незначительное количество поверхностных маркеров Т- и В-лимфоцитов, т.е. в обычных условиях проведения тестов не образующие Е- и М-розеток, не имеющие обнаружимых поверхностных иммуноглобулинов (Hokland et al., 1980). В результате повышения чувствительности методов обнаружения поверхностных

99

структур (использования для определения Т-лимфоцитов эритроцитов барана, обработанных АЕТ,папаином или нейраминидазой либо метода иммунофлюоресценции с моноклональными антителами, а для определения В-клеток - непрямых методов антиглобулинового розеткообразования или иммунофлюоресценции) в общей популяции лимфоцитов обнаруживают в сумме 100% и даже больше Т- и В-клеток, т.е. отсутствие нулевых клеток и даже дублирование определения клеток разных субпопуляций. Некоторые ученые предлагали отказаться от концепции нулевых клеток, однако дальнейшие работы доказали ее пользу в клинической практике. Основную массу нулевых клеток составляют зрелые Т- и В-лимфоциты с резко пониженной по тем или иным причинам физиологической активностью, а также юные формы этих клеток. В популяции нулевых лимфоцитов найдены клетки, проявляющие цитотоксическую активность, в их состав входят естественные киллеры (Abo, Balch, 1981; Ng, 1981). При использовании высокочувствительных методов анализа на нулевых клетках в небольших количествах удается обнаружить поверхностные маркеры Т-лимфоцитов (Е-рецепторы, антигены CD 3, CD 4, CD 8), В-лимфоцитов (поверхностные иммуноглобулины, Iаантигены), макрофагов (выявляемые ОКМ 1), естественных киллеров

(выявляемые HNK 1), Fc- и СЗ-рецепторы (Ng et al., 1981; Lobo, 1981; Hoffman, Ferrarini. 1985).

Использование в реакции розеткообпазования высокочувствительных эритроцитов барана, обработанных нейраминидазой, по сравнению с активными эритроцитами препятствовало выявлению различий в Е-розеткообразовании клеток больных и здоровых, а также определению изменений розеткообразования в нагрузочных тестах (Gelfand et al., 1979).

Все это свидетельствует о том, что высокая чувствительность методов при изучении такой сложной структуры, как ИКК, может иметь как положительное, так и отрицательное значение, и при определении необходимой степени чувствительности метода нужно всегда исходить из конкретных практических задач.

Точность. Некоторые исследователи считают, что метод тем лучше, тем он точнее. Так ли это? Для ответа на этот вопрос рассмотрим объект исследования. Кровь представляет собою динамическую систему, находящуюся в определенном балансе, в которой идет постоянный обмен веществом как между собственными компонентами, так и с другими системами. После взятия крови в пробирку этот баланс резко изменяется, что немедленно сказывается на физиологическом состоянии клеток и гуморальном составе среды. Дальнейшие операции по выделению клеток и плазмы или сыворотки еще более отдаляют количественные характеристики компонентов от таковых в крови.

Как было показано в гл. 1, иммуноглобулины находятся в крови как в растворенном состоянии, в плазме, так и на поверхности клеток, причем между этими состояниями существует динамическое равновесие. Естественно, что любые изменения в крови вызовут сдвиг этого равновесия в ту или иную сторону. Например, иммуноглобулиновый состав сыворотки зависит от величины образовавшегося сгустка, температуры, времени и многих других причин. Введение в кровь антикоагулянтов также сместит равновесие между поверхностными и растворенными иммуноглобулинами и таким образом повлияет на иммуноглобулиновый состав плазмы. Таким образом, ясно, что иммуноглобулиновый состав и сыворотки, и плазмы более или менее отличается от состава иммуноглобулинов в крови, причем из-за большого количества влияющих факторов самым непредсказуемым образом. На этом фоне слишком высокая точность определения иммуноглобулинов выглядит абсурдной. Поэтому точность большинства методов определения иммуноглобулинов, ошибка которых составляет 10 %, является вполне достаточной для практических целей клиники.Другой пример - определение в крови абсолютного содержания лейкоцитов, лимфоцитов и их субпопуляций, нейтрофилов и других элементов. Известно, что содержание

клеток в крови подвержено существенным (1,5-2-кратным) колебаниям, зависящим от биологиче-

ских ритмов, гормонального цикла, времени последнего приема пищи, диеты, уровня стресса и многих других причин, даже от положения тела во время взятия крови. Поэтому еще В. Шиллинг указывал на то, что высокая точность определения абсолютных показателей зачастую смысла не имеет.

Не будем больше приводить подобных примеров, отметим лишь то, что существуют объективные факторы, связанные с динамической природой самого объекта исследований - крови, которые лишают практического смысла слишком высокую точность ряда анализов.

Динамические свойства крови, необратимые изменения в ней после взятия и обработки заставляют внимательно и дифференцированно отнестись к определению необходимой точности иммунологических исследований. Это важно еще и потому, что каждый этап повышения точности обычно связан с усложнением методики, необходимостью использования дорогостоящих высокоочищенных реактивов. Если при изучении абсолютных значений показателей содержание иммуноглобулинов, клеток в объеме

100

крови) слишком высокая точность анализа практически бессмысленна, то при определении относительных значений (формулы клеток крови, состава субпопуляций) точность должна быть более высокой, поскольку соотношение компонентов в организме более постоянно. В любом случае слишком высокая точность метода теряет смысл при грубом выделении клеток для анализа, в частности, таком, при котором изменяются их соотношение и физиологические свойства.

Надежность. Любой иммунологический метод, особенно используемый в практике, должен безусловно обладать надежностью, которая состоит в постоянном гарантированном получении достоверного результата анализа каждого взятого образца с заданной точностью и чувствительностью.

Повышения надежности любого метода можно достигнуть за счет: а) создания упрощенных модификаций, включающих как можно меньше манипуляций; б) оптимизации режимов - так, чтобы небольшие отклонения от заданного режима не изменяли (или минимально изменяли) конечный результат, в) автоматизации и механизации процесса, т.е. сокращения риска субъективных ошибок.

Гарантией надежности метода должно служить четкое выполнение всех инструкций. Это объясняется тем, что если произвольное изменение какого-либо одного параметра методики может и не повлиять на получаемый результат, то изменения, пусть даже очень небольшие, одновременно нескольких параметров обязательно дадут суммарный эффект, который может изменить конечный результат весьма существенно.

Вопрос 5. От чего зависит большая или меньшая распространенность методов в клинической практике?

При равной информативности и материалоемкости наибольшее распространение, очевидно, получит метод, наиболее простой в исполнении. Простота исполнения может быть достигнута за счет создания упрощенной модификации, доступности используемых реактивов, использования автоматизированных или механизированных технологий.

Например, из известных методов определения содержания иммуноглобулинов наибольшее распространение получил метод радиальной иммунодиффузии по Манчини благодаря простоте, а также минимальному разнообразию и доступности необходимых реактивов и материалов. Популяризации этого метода способствовал и выпуск иностранными фирмами готовой коммерческой системы для определения иммуно-глобулинов методом радиальной иммунодиффузии.

Широкому распространению метода иммунофлюоресценции с моноклональными антителами способствовала разработка и продажа иностранными фирмами комплектов, включающих автоматический прибор для оценки результатов , лазерный проточный флюориметр; наборы готовых меченых моноклональных антител, других реактивов и подробное описание технологии, соответствующей параметрам прибора и характеристикам используемых реактивов. Таким образом, все наиболее сложные, трудоемкие и привно-сящие субъективизм операции осуществляют либо фирма, либо прибор, созданный ею; лаборанту остается лишь пунктуально выполнить небольшое количество несложных операций, которые подробно даны в прилагаемом описании технологии (с учетом возможных ошибок).

При наличии хорошей технологии и коммерческих стандартных наборов реактивов и материалов широкое распространение на практике может получить и метод розеткообразования, который за рубежом в последнее время потеснен методом проточной цитофлюориметрии.

Любой метод сможет завоевать признание в клинике только в том случае, если: а) метод доступен; б) получаемые с его помощью данные несут ценную для врача информацию; в) врач

умеет пользоваться этой информацией. Сегодня в клинической иммунологии проблема разра ботки доступных для практики методов в основном уже решена. Вторая проблема, ка-

сающаяся информативности того или иного метода, решается в тысячах публикуемых статей и книг. Но, к сожалению, вся эта масса публикаций не решает проблемы, ка- сающей-ся использования получаемых данных на практике. Исходя из научных публикаций, врач часто ожидает от того или иного метода большего, чем он может дать, а столкновение с реальной действительностью приводит к разочарованию в очередном новом методе, потере к нему всякого интереса и в результате упущению всего ценного, что этот метод мог бы дать при его правильном использовании.