Руководство по иммунофармакологии / 013306

чая (3-гексозаминидазную и Р-глюкуронидаз- ную, и вместе с протеазами представляют типичные лизосомные ферменты (см. выше). Тучные клетки, по-видимому, проявляют определенную фагоцитарную способность in vitro

иin vivo, захватывая коллоидное золото, вирусы

иядра сперматозоидов. Таким образом, помимо секреции гистамина тучные клетки с помощью гранул могут переваривать фагоцитируемый материал.

Тучные клетки и нейрогенное воспаление

Большинство исследований тучных клеток и базофилов было посвящено изучению их активации иммунными стимулами и их участия в аллергических реакциях. Но тучные клетки и базофилы реагируют и на ряд неиммунных стимулов, в том числе на основные пептиды и белки, нейтрофильный основной белок анафилатоксин (см. главу 12) и вещество Р. Так, медиаторы, связанные с нейтрофилами или с активацией системы комплемента, в свою очередь могут стимулировать выделение гистамина и других активных веществ из тучных клеток и базофилов. Выделение гистамина под действием нейропептидов (например, вещества Р) вызывает особый интерес, поскольку такие события служат основой для возникновения и распространения воспаления нервными механизмами. Например, расширение сосудов, которое наблюдается вокруг места травмы кожи, возможно, имеет нейрональную основу. В настоящее время показано, что чувствительные волокна, содержащие вещество Р, при

активации травмирующими стимулами выделяют вещество Р (основной ундекапептид), который в свою очередь способствует высвобождению гистамина. Выделившийся гиста-мин вызывает расширение сосудов и другие признаки воспаления.

Вещество 48/80, простой полиамин, в течение длительного времени использовался в качестве агента, вызывающего выделение гистамина из тучных клеток. Значение его влияния на тучные клетки неясно; однако, по некоторым данным, 48/80 вызывает выделение гистамина, действуя на рецептор вещества Р тучных клеток. Было бы интересно выяснить, какие еще основные пептиды, подобные анафилатоксинам, могут взаимодействовать с этим рецептором.

Список литературы

Beaven M.A., Маеуата К., WbldeMussie Е., АН Н. & Cunha-MeloJ.R.

(1987) Mechanism of signal transduction in mast cells and basophils: studies with RBL-2H3 cells. Agents Actions 20, 137145.

Healicon R.M. & Foreman J. С (1984) Receptors for immunoglobulin E (IgE). In: Conn P. M. (ed) The Receptors, vol. 1, pp. 83140. Academic Press Inc, Orlando, USA.

Metzger H., Alcarez G., Hohman R., Konet J.-P., Pribluda V. &

Quarto R. (1986) The receptor with high affinity for immunoglobulin E. Ann. Rev. Immuno. 4, 419-470.

Nakano Т., Kanakura Y., Nakahata Т.. Matsuda H. & Kita-mura Y

(1987) Genetically mast cell-deficient W/Wv mice as a tool for studies of differentiation and function of mast cells. Fed». Proc. 46, 1920-1923.

Stevens R.L., Rothenberg M.E., Levi-Schqffer F. & Austen K.F. (1987) Ontogeny of in u/Vro-differentiated mouse mast cells. Fedn. Proc. 46, 1915-1919.

Yee-Pang Yung & Moore M.A.S. (1985) Mast cell growth factor: its role in mast-cell differentiation, proliferation, and maturation.

Contemp. Top. Mol. Immunol. 10, 147179.

Таблица 2. Состав гранул нейтрофилов человека

компонентом содержимого гранул. К главным компонентам относятся нейтральные протеазы и некоторые другие вещества с микробицидной активностью.

Важнейшей нейтральной протеазой является основной белок эластаза. В экспериментах in vitro показано, что этот фермент разрушает коллаген, эластин (протеогликан хрящей), фиброноген, фибрин и базальную мембрану. Эластаза действует на компоненты комплемента, превращая С5 в С5а, и может функционировать, как СЗ-конвертаза, выделяя СЗЬ из СЗ (см. главы 1 и 12). Показано, что данный фермент способен генерировать брадикининоподобный кинин, который увеличивает проницаемость сосудов (см. главу 13). Азурофиль-

Рис. 13. Сканирующая электронная микрофотография нейтрофила.

ные гранулы также содержат коллагеназу и катепсин G. Катепсин G, будучи протеазой серина, обладает высокой основностью и профилем активности, сходным с эластазой. В нормальных условиях нейтральные протеазы, выделившиеся из клетки, подавляются сцантитрипсином и сц-протеиназным ингибитором.

К микробицидным субстанциям азурофильных гранул относятся лизоцим и миелопероксидаза. Миелопероксидаза проявляет бактерицидную активность в присутствии перекиси водорода и хлорида. Лизоцим разрушает связи между мурамовои кислотой и N- ацетилгликозамином, которые являются ключевыми молекулами полисахаридного каркаса клеточной стенки бактерий. (У некоторых бактерий лизоцим неспособен проникать через липопротеиновыи слой на внешней стороне клеточной стенки и поэтому не достигает своей мишени.)

По своим размерам специфические гранулы (диаметр 0,2 мкм) меньше азурофильных, но по количеству превосходят их в 2- 3 раза. Они содержат лизоцим, коллагеназу, лактоферрин (белок, связывающий железо) и белок, связывающий витамин В12. Лактоферрин участвует в контроле гранулопоэза по принципу отрицательной обратной связи. Специфические

дящий из плазменного белка, способствует усилению фагоцитоза, возможно, посредством уменьшения электростатического отталкивания между частицей и клеткой.

Выделение содержимого гранул, или экзоцитоз

Экзоцитоз обычно определяют как «выделение лизосомных ферментов», хотя, строго говоря, гранулы не могут рассматриваться только как лизосомы.

Содержимое гранул может пассивно выделяться при повреждении клеток токсинами или при поглощении кристаллов. Активное выделение (секреция) может наблюдаться в ряде описанных ниже ситуаций.

Экзоцитоз при фагоцитозе

Известно, что различные ферменты, секвестрированные в покоящейся клетке, выделяются в процессе переваривания частиц совместно. Предположительно это обусловлено выделением содержимого гранул в фагоцитарную вакуоль прежде ее закрытия с внешней стороны (что сравнимо с рвотой во время еды).

Если поверхность хряща или какая-либо аналогичная поверхность покрыта иммунными комплексами или другими реактантами, стимулирующими фагоцитоз (агрегированные иммуноглобулины, производные комплемента

идр.), то нейтрофилы могут к ней прикрепляться и выделять содержимое гранул; это называют «незавершенным фагоцитозом». В этом процессе участвуют те же рецепторы, что

ипри фагоцитозе,- Fc и СЗЬ.

Регургитация, незавершенный фагоцитоз и пассивное выделение содержимого гранул могут лежать в основе определенных повреждений тканей при ревматоидном артрите, бронхите, респираторном дистресс-синдроме взрослых, некоторых типах васкулитов и нефритов. сц-Протеиназный ингибитор (а-пи), один из основных факторов, защищающих ткани организма от действия выделяющихся нейтральных протеаз, чувствителен к окислительной инактивации, а главным источником окислителей являются нейтрофилы.

Экзоцитоз, вызванный обработкой цитохалазином В

Нейтрофилы, обработанные цитохалазином В, в ответ на растворимые хемотаксины, такие

как С5а или формилпептиды (см. ниже), или же на частицы, стимулирующие фагоцитоз, выделяют наружу содержимое своих гранул. Цитохалазин В-это грибковый метаболит, который

вконцентрациях 10-6 - 10-5 М взаимодействует с двигательным аппаратом клетки, подавляя тем самым фагоцитоз и локомоцию. Подобно гельзолину, он растворяет гелевые комплексы актин-АСБ1 за счет связывания с АСБ и усиливает актиновые нити (см. главу 18). Однако в отличие от гельзолина он оказывает общее действие на клетку, что приводит к дезорганизованным сокращениям вместо контролируемых местных эффектов. Содержимое гранул выбрасывается в местах инвагинации плазматической мембраны. Данный феномен является по существу артефактом in vitro, но он весьма полезен как средство изучения некоторых аспектов клеточной реакции на внешние стимулы. Так, обработка клеток цитохалазином В часто используется для изучения механизмов передачи сигналов при хемотаксисе. Однако следует учитывать, что получаемая при этом информация об экзоцитозе, особенно с азурофильными гранулами, может служить лишь общим ориентиром в отношении передачи сигнала при хемотаксисе. В таких экспериментах клетка статична и, скорее всего, принимает округлую форму благодаря равномерной концентрации хемотаксина. В организме же клетка движется по градиенту хемотаксина, а события, вызванные взаимодействием хемотаксин-рецептор, почти всегда происходят

вголовном конце клетки.

Экзоцитоз при использовании только растворимых стимуляторов

Некоторые вещества могут вызывать дегрануляцию нейтрофилов и в отсутствие цитохалазина В. Среди них можно отметить миристилацетат (ФМА, коканцероген), конканавалин А (растительный лектин), ионофор кальция А23187 в низких концентрациях и интер- лейкин-1. Особенностью этих веществ является способность вызывать относительно селективное выделение содержимого специфических (но не азурофильных!) гранул. Селективное выделение содержимого специфических гранул происходит и при хемотаксисе нейтрофилов через фильтр in vitro, и при их аккумуляции в кожных камерах и волдырях in vivo (рис. 14);

1 АСБ-актинсвязывающий белок.

38 Глава 3

Таблица 3. Относительная стимулирующая нейтрофильная активность синтетических пептидов

вила 7*10-11 M. В других исследованиях показано, что ф.норлей-лей-фен обладает почти такой же активностью, что и ф.мет-лей-фен. В природе норлейцин не встречается, но по своей структуре он близок к метионину и может замещать его в белковом синтезе бактерий.

Очень специфическая зависимость струк- тура-активность для реакции на пептиды предполагает их взаимодействие со специфическими рецепторами на плазматической мембране нейтрофилов; в пользу этого свидетельствует способность биологически неактивных пептидов конкурировать с активными пептидами в ряде биологических систем. К таким пептидам-антагонистам относятся карбобен- зокси-фен-мет (КБ-фен-мет) и 5-бутоксикарбо- нил-фен-лей-фен-лей-фен (БК-фен-лей-фен-лей- фен). Хотя построение графика Шилда и вычисление значений рА2 не производились, было показано, что КБ-фен-мет, использованный в одной концентрации, вызывает параллельный сдвиг кривой доза-эффект для выделения лизоцима и для хемотаксиса, причем без уменьшения максимального ответа.

При определении связывания с нейтро-

филами человека ф.норлей-лей-фен-норлей- [125I]тир-лиз, ЕД50 которых для хемотаксиса

составляет 4 10 "М, было получено быстрое и обратимое насыщаемое связывание при 24°С с константой равновесной диссоциации 1,3*10-9 М, а количество мест связывания достигало 120000. Сходные значения получены на найтрофилах кролика при использовании ф.норлей-лей-фен. Следует отметить, что ЕД50 для хемотаксиса составила 7*10-11 М, поэто-

му для возникновения данной реакции необходимо связывание пептидов лишь с небольшой частью рецепторов-явление, часто наблюдаемое при взаимодействии препарат - рецептор на других типах клеток. Оптимальное связывание отмечается при рН 6,75. Относительная активность пяти пептидов при конкурентном вытеснении меченого лиганда из мест связывания коррелирует с их относительной активностью как хемотаксинов. IC50 1 для ингибирования связывания составила 4,5*10-5 М, а для

ингибирования хемотаксиса-приблизительно 10-

5 М.

В одном из исследований показано, что при взаимодействии нейтрофилов с пептидами происходит расщепление пептидов на составляющие их аминокислоты. Ингибиторы протеаз или избыток субстрата тормозят этот процесс, на основании чего можно предполагать существование пептидазы, связанной с рецептором. Не исключено, однако, что большинство пептидных лигандов интернализируется перед деградацией (см. ниже).

Совершенно очевидно, что на поверхности нейтрофилов имеются рецепторы для небольших ф.мет-пептидов, а в недавних исследованиях было показано, что данные пептиды являются природными хемотаксинами, продуцируемыми бактериями. Проводимые в настоящее время исследования направлены на выделение и структурное определение этих рецепторов.

Механизмыпередачисигнала

Рольполифосфоинозитидов

В клетках многих типов частью процесса сопряжения «сигнал-активация» является опи-

санный Nishizuka (1984) и Berridge, Irvine (1984)

распад полифосфоинозитидов. После стимуляции рецептора происходит гидролиз очень небольшого компонента клеточной мембраныфосфатидилинозитолдифосфата (ФИФ2)-при участии кальцийнезависимой фосфолипа-зы С. В результате гидролиза образуются два внутриклеточных посредника: инозитолтрифосфат (ИФА мобилизующий внутриклеточный кальции, и диацилглицерол (ДАГ), активирующий протеинкиназу С. Подобные процессы протекают и в нейтрофилах, что было

1 1С50-концентрация ингибитора, которая необходима для 50% уменьшения максимального ответа.

Рис. 16. Влияние 10 7 М ф.мет-лей-фен на распад 4,5- дифосфата фосфатидилинозитола.

Клетки предварительно метили 32Р. Результаты выражены в процентах изменения меченого фосфолипида. Показаны отсутствие (светлые кружки) и присутствие (темные кружки) кальция во внешней среде [Dougherty и соавт.- Biochem J., 1984, 222, 307].

Рис. 17. Влияние Ю-7 М ф.мет-лей-фен на образование инозитол-трифосфата в клетках, предварительно меченных [3Н]-инозитолом. Результаты представлены в процентах от радиоактивности, связанной с фосфатидилинозитолом, которая составила примерно 70 000 cpm/мг белка. Кривая с темными кружками-контрольные клетки; кривая со светлыми кружками-клетки, стимулированные в нулевое время ф.мет-лей-фен. По Dougherty и соавт., 1984.)

■

показано достаточно четко. При стимуляции нейтрофилов ФМЛФ происходит распад ФИФ2, даже в отсутствие внеклеточного кальция (рис. 16), и образуются ИФ3 и ДАГ

(рис. 17).

1,5 г-

Время, с

Роль кальция

Кальций-важная внутриклеточная передаточная молекула для таких реакций нейтрофилов, как хемотаксис и дегрануляция. При движении