Руководство по иммунофармакологии / 013306

проницаемость небольших сосудов и экссудацию плазмы. По крайней мере в коже ВП способствует высвобождению продуктов тучных клеток и может быть фактором хемотаксиса клеток воспаления. Все это свидетельствует о возможном участии ВП в патофизиологии астмы, а также о нейрогенной природе некоторых воспалительных изменений дыхательных путей.

Недавно из дыхательных путей млекопитающих были выделены другие тахикинины (ВПподобные пептиды), действующие на рецепто-

ры, отличные от рецепторов для ВП. Один из них-нейрокинин А-является гораздо более сильным спазмогеном дыхательных путей человека, чем ВП. Новый пептид, обнаруженный при альтернативном тканевом процессинге гена кальцитонина и названный пептидом, связанным с геном кальцитонина (ПСГК), выявлен в сенсорных нервах дыхательных путей, причем он локализуется вместе с ВП. ПСГК является очень сильным бронхоконстрикто-ром in vitro, а также мощным вазодилата-тором.

224 Глава 21

Аксон-рефлексы

Образование волдырей и покраснение кожи в ответ на повреждение тканей является нейрогенным процессом, причем ВП принимает в нем участие через аксон-рефлекс. Сходные аксонрефлексы найдены в кишечнике; вероятно, они будут обнаружены и в дыхательных путях, которые имеют общее эмбриональное происхождение с кишечником. При астме, даже при относительно легком ее течении, выявлено повреждение эпителия. При повреждении обнажаются окончания афферентных нервов, которые активируются медиаторами воспаления. Окончания немиелинизированиых С-волокон избирательно активируются брадикинином, медиатором, образующимся из высокомолекулярного кининогена в плазме под действием ферментов, выделяющихся клетками воспаления (в том числе тучными клетками). Брадикининсильный бронхоконстриктор при астме, однако он не действует на нормальные дыхательные пути, a in vitro вызывает лишь незначительные сокращения дыхательных путей человека. У животных брадикинин вызывает выделение сенсорных нейропептидов из немиелинизированиых нервов; именно таким образом при астме брадикинин может стимулировать обнаженные окончания нервов дыхательных путей, вызывая выделение сенсорных нейропептидов в результате аксон-рефлекса (рис. 95). Это приводит к бронхоспазму, секреции слизи, экссудации плазмы и отеку бронхов. Возможно, что местные механизмы или аксон-рефлексы вносят свой вклад в воспаление дыхательных путей при астме. Ввиду эффективной блокады бронхоспастических эффектов брадикинина хромогликатом и недохромилом

можно предположить, что защитный эффект данной группы препаратов связан с действием на аксон-рефлекс через подавление выделения сенсорных нейропептидов.

Заключение

Растет число данных, свидетельствующих о влиянии медиаторов воспаления на вегетативный нервный контроль дыхательных путей при астме. Они могут проявляться на нескольких уровнях: на уровне активации афферентных рецепторов, выделения нейротрансмиттеров, рецепторов вегетативной нервной системы и их сопряжения с эффекторными механизмами. Пока получено мало информации о значимости этих механизмов в физиологии дыхательных путей человека, а также при астме. Кроме того, нервные механизмы могут влиять на выделение медиаторов и воспаление. Секреция тучных клеток модулируется факторами вегетативной нервной системы и нейропептидами, а нейрогенное воспаление через аксон-рефлекс или ганглионарный рефлекс может вносить свой вклад в патогенез астмы и бронхиальной гиперреактивности.

При поиске и разработке новых лекарственных средств в настоящее время трудно обойтись без экспериментальных моделей. Это справедливо также для фармакологии воспаления и гиперсенситивности. Воспаление является сложным, многофакторным процессом, в котором принимают участие как микроциркуляция, так и многие факторы, вовлекающиеся в микроциркуляцию. Большое количество химических медиаторов вовлекается в контроль воспаления, но точные механизмы их действия остаются неясными. Вероятно, когда-нибудь мы придем к более глубокому пониманию воспалительных процессов и получим возможность продвигаться вперед, используя эксперименты in vitro, но пока мы еще далеки от такого уровня знаний.

Слово «модель» может иметь несколько значений. Во-первых, модель может быть точной копией, изготовленной или в натуральную величину, или в уменьшенном масштабе. Альтернативно модель может представлять собой упрощенную систему, используемую для изучения сложных процессов. Животные модели относятся к последнему случаю. Иммунофармакологи нуждаются в упрощенной системе in vivo для исследования терапевтических средств.

Идеальная животная модель должна отвечать нескольким основным требованиям.

1.Модель должна обеспечивать детальное исследование и количественное определение тех или иных параметров. Для воспаления весьма важно, чтобы клинические наблюдения (отек, накопление клеток, боль и жар) коррелировали с биохимическими измерениями, например с концентрациями химических медиаторов.

2.Модель должна быть воспроизводимой и обеспечивать выполнение достаточного количества экспериментов для статистического анализа.

3.Система должна обеспечивать определение небольших количеств веществ, синтезируемых биохимиками.

На практике экспериментаторы используют набор различных животных моделей для выяснения тех или иных специфических вопросов.

Сделав заключение о неадекватности моделей воспаления in vitro, читатель должен иметь в виду, что в настоящее время не существует моделей, полностью соответствующих воспалительным заболеваниям человека. Сегодня мы не располагаем адекватными моделями хронического воспаления и все, чего мы можем достигнуть с помощью набора доступных тестов, - это предопределить и оценить активность новых соединений, но не их побочных эффектов. Животные модели заболевания у лабораторных животных или других видов не могут заменить клинические исследования.

Классификации воспалительных реакций

Поскольку воспалительная реакция является слишком сложным процессом, было бы целесообразно разделить ее на несколько типов. На рис. 96 представлена простая классификация воспаления. Разделение на острое и хроническое воспаление имеет важное значение при разработке или интерпретации животных моделей. Для гистолога острое воспаление определяется наличием полиморфно-ядерных лейкоцитов (см. главу 3). Хроническое воспаление, напротив, характеризуется наличием мононуклеарных клеток (макрофагов и лимфоцитов) (см. главы 6 и 7). Таким образом, для иммунофармаколога желательно иметь животные модели, позволяющие регистрировать лекарственные эффекты в отдельных клеточных популяциях.

Воспаление, которое в своих внешних проявлениях всегда одинаково, может быть результатом активации многих различных химических медиаторных систем (см. часть 2). Классификация должна охватывать разные типы инициации. С этой целью используются два типа воспаления: иммунный и неиммунный.

чение для определения ингибиторов циклооксигеназы (см. главу 25). Интересно отметить, что в практику он был введен при разработке индометацина.

Модель отека задней лапы крыс остается наиболее признанным тестом при определении противовоспалительной активности. У данной системы имеется ряд преимуществ перед другими моделями. Главные ее достоинстваудобство и воспроизводимость.

Используя одну группу крыс, можно определить развитие отека во времени, что снижает стоимость исследования. Наибольшим неудобством модели является сложность количественного определения. Лапа отекает вследствие введения раздражителя, поэтому при завершении измерений невозможно исследовать клетки и их изменения под действием лекарственных препаратов. Клеточный компонент может быть определен на гистологических срезах, что требует значительных затрат времени.

Экспериментальный плеврит

Введение раздражающих веществ в закрытые полости тела приводит к образованию жидкого экссудата с большим содержанием клеток. Первоначально использовалась брюшная полость, однако ее обширные размеры и присутствие желудочно-кишечного тракта затрудняют количественное определение объема жидкости и ее состава. Наиболее подходящей полостью для изучения воспалительной реакции оказалась плевральная полость.

Экспериментальный плеврит в течение многих лет использовался для изучения воспалительных реакций, а не для поиска противовоспалительных веществ. В последние 15 лет модель стали широко использовать фармакологи. В данной системе ирритант вводят в плевральную полость крыс. Обычно кожу на одной стороне грудной клетки оттягивают и лезвием скальпеля делают разрез над III и IV ребрами. С помощью толстой иглы 0,1 мл раздражающего вещества (обычно каррагенана) вводят в

плевральную полость (рис. 98). Для получения экссудата без примеси крови вновь используется толстая игла. При загрязнении экссудата кровью его следует отбросить. Исследуемое соединение вводят перед внутриплевральной инъекцией ирританта. Животных забивают через 4 или 24 ч, удаляют экссудат, измеряют его объем, а также проводят общий и дифференцированный подсчет клеток. В опытных руках система дает исключительно воспроизводимые

Время, ч

Рис. 99. Накопление клеток и образование экссудата в плевральной полости после введения каррагенана.

результаты как в отношении объема экссудата, так и при подсчете клеток (рис. 99). В течение ряда лет использовались различные ирритан-ты, включая терпентин (к его недостаткам относится разрушение мигрирующих лейкоцитов) и каррагенан. Каррагенановый плеврит обеспечивает выделение гистамина, 5-окси- триптамина, кининов и простагландинов.

Экспериментальные модели плеврита позволяют выявить ингибиторы циклооксигеназы, такие как классические нестероидные противовоспалительные препараты и новые двойные блокаторы, подавляющие циклооксигеназ-ные и липоксигеназные ферменты, например BW755C. Однако эту систему нельзя использовать для определения медленно действующих препаратов или препаратов, модифицирующих заболевание, таких как D-пеницилламин (см. главу 31), левамизол или золото (см. главу 32), которые обладают терапевтической активностью при лечении хронических воспалений суставов. Напротив, эти вещества потенцируют воспалительную реакцию в данной системе.

Возможным ирритантом, вызывающим воспаление, наиболее близкое к клиническому, является кальций-пирофосфатдигидрат (КПФДГ). Его кристаллы вызывают неиммунную реакцию. Причиной их выбора в качестве ирританта является их обнаружение в суставах больных хондрокальцинозом или псевдо-

230 Глава 22

подагрой. В отличие от каррагенана действие КПФДГ не зависит от системы комплемента, однако медиаторы выделяются в той же последовательности. Ответ на стероидные и нестероидные препараты сравним с ответом на модели каррагенанового плеврита. К достоинствам данной системы следует отнести тот факт, что сравнение полученных данных с результатами каррагенанового теста позволяет дать заключение о действии препаратов на систему комплемента. Препараты, подавляющие воспаление, зависимое от комплемента, неактивны в отношении плеврита, вызванного КПФДГ.

Предполагается, что в моделях плеврита можно определять стероидные и нестероидные препараты по их действию на 24-часовое повреждение. Однако это предположение следует подтвердить.

Кдостоинствам модели плеврита относятся

еелегкая объективизация и доступность как экссудата для биохимического анализа, так и клеток для морфологического исследования. Недостатком модели является необходимость подготовки группы животных для каждого временного интервала, что представляет сложность для оператора и повышает стоимость эксперимента.

Шестидневныйвоздушныйпузырь

Первоначально Ганс Селье показал, что введение воздуха в дорсальную поверхность крыс приводит к образованию полости, в которой можно изучать воспаление. С тех пор обнаружено, что воздушный пузырь можно использовать в качестве модели острого воспаления через 6 дней после его образования. При этом методе анестезированной крысе вводят 20 мл воздуха в дорсальную поверхность. Через 3 дня для поддержания полости в неспавшемся состоянии вводят дополнительно 10 мл воздуха, а через 6 дней после первого введения воздуха в полость вводят раздражающее вещество. Необходимо именно 6 дней для развития структур, выстилающих полость. Выстилающая структура, состоящая из макрофагов и фибробластов, обладает некоторым сходством с синовиальной тканью, выстилающей полость сустава. Развитие этой выстилающей структуры позволяет определить реакцию на ирритан-ты в течение 24 ч. Как и в плевральной полости, в воздушном пузыре образуется бесклеточный экссудат, который можно оценить количественно и качественно (рис. 100). Одно-

Рис. 100. Индукция воспаления в 6-дневном воздушном пузыре.

дневный воздушный пузырь непригоден для изучения острого воспаления.

К достоинствам данной системы относится возможность прямого определения соединений для лечения синовитов, а недостатками являются большая затрата времени для получения самого воздушного пузыря и необходимость адаптации животных.

Имплантацияполиэфирнойгубки

В ряде исследований для моделирования острого воспаления используются кусочки полиэфирной губки, которые имплантируются крысам подкожно. У анестезированных животных делают разрез на вентральной или дорсальной поверхности. Губку грубо рассекают, смачивают ирритантом (каррагенаном) и помещают

232 Глава 22

.мой гранулематозной ткани. Показано, что продукты гранулематозной ткани потенциально антигенны и, возможно, действуют, как эндогенный антиген. Выявлено значительное уменьшение реакции на кусочки хлопка при неонатальной тимэктомии, что свидетельствует о представлении в ней иммунного компонента Т-клетками. В данной системе определяются нестероидные противовоспалительные препараты и стероиды, причем последние активны

вочень низких дозах. Метод прост в выполнении, но требует введения исследуемых веществ

втечение 7 дней, что не всегда желательно при поиске новых соединений, доступных только в малых количествах. В этом тесте выявляется влияние веществ на миграцию и пролиферацию клеток; к его недостаткам следует отнести необходимость детального гистологического исследования.

Шестидневныйвоздушныйпузырь

Выше уже был описан 6-дневный воздушный пузырь, используемый для изучения острого воспаления. Эта модель наиболее пригодна и для исследования хронического воспаления, а именно-синовита. Ввиду его размеров большое количество каррагенана или другого ирри-танта вводят в полость и измеряют развивающееся воспаление. Первоначально доминируют полиморфно-ядерные клетки, которые сменяются преимущественно мононуклеарными популяциями. Применяя в качестве ирританта каррагенан, с помощью нестероидных противовоспалительных препаратов можно подавить клеточную и экссудативную реакцию. В последнее время распространение получила модификация, при которой в 6-дневный пузырь вносится хрящ. Есть надежда, что подобная модификация поможет фармакологам в поиске веществ, предупреждающих эрозию твердых тканей при артритах.

Иммунное хроническое воспаление

Клеточно-опосредованный экспериментальныйплеврит

У крыс и морских свинок могут быть индуцированы клеточно-опосредованные воспалительные реакции. Морских свинок сенсибилизируют полным адъювантом Фрейнда. Спустя 2,5-4 нед сенсибилизированным животным внутриплеврально вводят разрешающую дозу

Рис. 101. Клеточное накопление и образование экссудата в плевральной полости у морской свинки после введения туберкулина.

очищенного белка туберкулезных бацилл. В плевральной полости реакция развивается медленно, достигая максимума через 18-24 ч после инъекции. При типичной реакции через 6 ч после введения очищенного белка образуется 0,5 мл экссудата, а к 18-му часу-5 мл; затем реакция медленно затухает, и к 48-72-му часу плевральная полость возвращается к исходному состоянию. Экссудат содержит много клеток, в основном мононуклеарного типа (рис. 101).

В отличие от реакции Артюса туберкулиновая реакция почти не вызывает выделения гистамина в плевральную полость, зато в умеренном количестве выделяется 5-окситрипта- мин. Содержание простагландинов достигает максимума примерно к 12-му часу, что по времени близко к пику воспалительной реакции.

Почти тотальное удаление периферического комплемента не влияет на развитие клеточных и сосудистых реакций.

Клеточно-опосредованные иммунные реакции могут также индуцироваться в плевральной полости крыс при введении вакцины Вогdetella pertussis. Крысам, сенсибилизированным коклюшной вакциной в неполном адъю-ванте Фрейнда, внутриплеврально вводят разрешающую дозу той же вакцины. Это приводит к образованию экссудата (максимум при-