Руководство по иммунофармакологии / 013306

152 Глава 14

синтез белка, который измеряется по включениям лейцина, меченного тритием, может служить индексом активации лимфоцитов, поскольку с его помощью можно определить синтез лимфокинов, клеточную дифференциацию и пролиферацию.

В течение какого-то времени общепринятым было мнение о том, что митогенный компонент препаратов лимфокинов является поликлональным митогеном. Недавно было показано, что лимфокины представляют собой необходимый кофактор активации лимфоцитов

ичто активный материал (стимуляция митогенной активности тимоцитов, костимулирующая активность, хелперная активность клеток-киллеров или вторичная активность, индуцирующая цитотоксические Т-клетки) принадлежит одному веществу-интерлейки-ну- 2. Интерлейкин-2 и монокин - интерлей-кин-1 (см. главу 15) являются хемотаксически-ми факторами лимфоцитов. Напротив, супрессорные Т-клетки выделяют ингибиторный лимфокин, растворимый супрессор иммунного ответа (РСИО), который угнетает синтез антител

иДНК при стимуляции клеток Т- и В-ми- тогенами, а также подавляет реакцию смешанных лимфоцитов. Лимфокины принимают участие в регуляции антительного ответа на антиген. Например, детально изучена регуляция синтеза IgE В-лимфоцитами. Т-помощники секретируют IgE-связывающий фактор (IgE-СФ)

ифактор, усиливающий гликозилирова-ние, а Т- супрессоры секретируют фактор, подавляющий гликозилирование. Контроль синтеза IgE достигается относительным вкладом этих факторов, так как IgE-СФ стимулирует синтез и секрецию IgE В-лимфоцитами, а гликозилированный IgE-СФ их подавляет.

Макрофаги

Лимфокинами инициируется широкий спектр функций макрофагов, включая подавление миграции, нарушение электрофоретической подвижности, повышение цитотоксичности, хемотаксис и пролиферацию. Лимфокины были впервые описаны при использовании метода подавления миграции макрофагов, а соответствующий биологически активный материал был назван фактором, ингибирующим миграцию (ФИМ). Этот метод интенсивно применяется при исследовании лимфокинов в связи с параллельной чувствительностью к антигену in vitro и in vivo и широко принят как индикатор клеточного иммунитета in vitro. По мере

Рис. 66. Кривая доза-эффект подавления миграции макрофагов in vitro стандартным препаратом лимфокина (с учетом среднего значения и стандартного отклонения). (По Вгау и др., 1976.)

становления метода ингибирования миграции макрофагов в качестве классического определения активности лимфокинов (рис. 66) выяснялась способность лимфокинов к имитации хорошо известных функций макрофагов, связанных с клеточным иммунитетом, а именно-с активацией макрофагов. Эта активность проявляется усилением движения, фагоцитоза и прилипания к стеклу, а также увеличением бактерицидных и тумороцидных эффектов. Все эти формы активности связаны с другим лим- фокином-фактором активации макрофагов (ФАМ). ФАМ представляет первую стадию двухэтапного процесса примирования макрофагов для их стимуляции вторым сигналом,

Рис. 67. А-накопление клеток в коже (дерма) после местного введения 100 мкг лимфокина. Точки соответствуют среднему значению (+ страндартная ошибка) плотности мононуклеарных (треугольники) инейтрофильных(кружки) клеток в повреждениях, возраст которых указанпоосиабсцисс. Значительное накопление клеток наблюдается через 30 мини24 чдлямононуклеарныхклетоки через 3 и 6 ч-для нейтрофилов. Б- накопление клеток в подкожном слое после местного введения 100 мкг лимфокина. Точкисоответствуютсреднему значению (± стандартная ошибка) плотности мононуклеарных (треугольники) инейтрофильных(кружки) клеток в повреждениях, возраст которых указанпоосиабсцисс. Значительное накопление нейтрофилов наблюдается через6, 12 и24 ч[Franco исоавт.- Amer. J. Pathol, 1979, 93, 117].

например липополисахаридом. Исчезновение in vivo макрофагов после введения лимфокина может быть обусловлено одним (или более) из этих ферментов in vitro.

Гранулоцнты

Показано, что препараты лимфокинов вызывают активацию гемопоэтических клеток (колониестимулирующий фактор). Действие лимфокинов на зрелые гранулоциты параллельно их действию на макрофаги и проявляется усилением прилипания к субстрату, образованием кластеров клеток, подавлением их миграции и повышением фагоцитарной активности. Хемотаксическая активность препаратов лимфокинов проявляется по отношению к нейтрофилам, эозинофилам и базофилам, а внутрикожная инъекция лимфокинов вызывает нейтрофильную инфильтрацию (рис. 67).

Остеокласты

Препараты лимфокинов вызывают резорбцию костей. В гистологических образцах тканей после лечения лимфокинами обнаруживается увеличение количества остеокластов. Ввиду этого было сделано предположение, что вызванная лимфокинами резорбция кости связана с активацией остеокластов. Этот процесс не зависит от ПГЕ2, которые также способен вызывать резорбцию при данной системе определения и, следовательно, может представлять собой непрямой механизм резорбции кости в случае стимуляции воспалительных клеток лимфокинами.

Сосудистыйэндотелий

Уже давно известно, что внутрикожные инъекции лимфокинов вызывают воспалительные

154 Глава 14

реакции с индурацией и эритемой, возникающими через 2-4 ч. Изменения проницаемости, которые лежат в основе отека при таких реакциях, были детально изучены с помощью техники непрерывной регистрации. При этом выделены ранний компонент (мепираминчувствительный) и два поздних компонента. Воспалительная активность классических препаратов лимфокинов относительно низка (рис. 68), однако следует отметить, что они способны повышать проницаемость капилляров, что показано с помощью частиц угля. Эритема, вызванная лимфокинами, отличается от эритемы, обусловленной простагландинами, тем, что она не сопровождается усилением кожного кровотока и проявляется преимущественно расширением капилляров со стазом. С другой стороны, монокины-интерлейкин-1 и фактор некроза опухолей (ФНО-а)- являются сильными воспалительными агентами у человека.

Другие эффекты лимфокинов

Определяются и другие формы активности лимфокинов, которые не связаны с конкретным типом клеток-мишеней, а именно: цитотоксичность и антивирусная активность.

Эффекты цитотоксического лимфокина, называемого «лимфотоксином», отличаются от цитотоксических эффектов лимфоцитов тем, что для их максимального проявления требуется 2448 ч. Монокин ФНО-а цитотоксичен in vitro для многих трансформированных клеточных линий; нормальные клетки им не повреждаются. In vivo ФНО-а вызывает геморрагические некрозы и деструкцию центральных опухолевых масс саркомы у мышей.

В препаратах лимфокинов присутствует антивирусная активность. Данная активность, продуцируемая активированными лимфоцитами, в настоящее время называется иммунным интерфероном (ИФН-у) и является лимфокином по определению. Вообще, эффекты, проявляемые иммунным интерфероном в отношении различных клеток, отличаются от эффектов интерферона, индуцированного вирусами. Помимо защиты от вирусов он осуществляет подавление клеточного деления и образования антител, а также усиливает некоторые функции клеток, например активность естественных клеток-киллеров и экспрессию антигенов гистосовместимости на клеточной поверхности. По иммунодепрессивной активности иммунный интерферон в 250 раз пре-

Рис. 68. Кривая доза-эффект, показывающая увеличение сосудистой проницаемости после введения лимфокина (ЛK-I). Накопление белка плазмы регистрируется в мкл эквивалента цельной крови с учетом среднего значения и стандартного отклонения (по Bray и др., 1976).

восходит вирусиндуцированный интерферон (при проведении сравнения на основе противовирусной активности).

Биохимические характеристики

Несмотря на многократные попытки охарактеризовать и очистить лимфокины и монокины, эта задача пока остается недостижимой. Это связано с рядом свойств системы лимфокинов. Лимфокины обычно получают из супернатантов культур, где они содержатся только в малых количествах и в низких концентрациях. Удачные партии лимфокинов обладают

разными формами биологической активности. Кроме того, для образования лимфокинов необходимо применение индуцирующего агента, биохимический профиль которого часто перекрывает биохимический профиль присутствующих в культуральной среде лимфокинов и количество которого может доминировать в субфракциях, содержащих лимфокин. Аналогичные трудности возникают при использовании сывороточных белков, добавляемых в культуру для повышения выхода лимфокинов. Фракционирование препаратов лимфокинов обычно приводит к значительным потерям биологической активности, нивелируя любое увеличение специфической активности. Эти трудности особенно ограничивают очистку небольших партий, поскольку биологические методы определения активности лимфокинов относительно малочувствительны и для их проведения требуется значительное количество материала. Хотя первоначально потеря активности связывалась с нестабильностью препаратов, впоследствии измерение стабильности и успешное применение носителей при фракционировании ФИМ и лимфотоксина показали, что проблема обусловлена неспецифической абсорбцией на поверхности контейнеров, а также материала колонок.

Значительное несоответствие значений молекулярной массы ФИМ в разных лабораториях прямо свидетельствует о критической зависимости точной биохимической природы данной активности лимфокинов от выбранного способа ее получения. В соответствии с этим выводом находится и наблюдение, касающееся зависимости молекулярной массы митогенного фактора (МФ): он имеет молекулярную массу 20 00025 000 независимо от индуцирующего антигена, но значение изоэлектрической точки (pi) определяется антигеном, используемым при получении лимфокина. Сведения о природе лимфокинов были получены при исследованиях их чувствительности к ферментативному воздействию. В результате было сделано заключение о белковой или гликопротеиновой природе лимфокинов. Часто отмечается гетерогенность препаратов лимфокинов; например, активность ФИМ у морских свинок сочетается с гликопротеиновым 65000 D (pi 3,0-4,5) и протеиновым 25000-43000 D (pl 5,0- 5,5) компонентами.

Не исключено, что некоторые формы активности, которые в настоящее время связывают с лимфокинами, в действительности принадлежат низкомолекулярным веществам, ас-

Лимфокины 155

социированным с несущими макромолекулами. Например, ингибитор пролиферации лимфоцитов идентифицирован как полярный гликолипид, соединенный гидрофобными связями с белком-носителем. Чрезвычайно высокая активность фосфолипидных метаболитов и пеп- тидно-липидная природа лейкотриенов С4 и D4 свидетельствует в пользу этого предположения. Конечно, высокая активность лейко-триена В4 (5,12-дигидроксиэйкозатетраеноевая кислота) и фактора активации тромбоцитов при хемотаксисе говорит о том, что наличие ничтожного загрязнения может обусловить высокую хемотаксическую активность во многих препаратах лимфокинов. Известно, что очищенный бычий сывороточный альбумин (БСА) содержит связанные жирные кислоты, от которых можно освободиться с помощью специальной обработки. Поскольку ацетилирование препаратов БСА приводит к появлению значительной биологической активности, неотличимой от ФАТ и полностью подавляемой селективными антагонистами ФАТ, не исключено, что такие препараты БСА содержат сорбированный лиз-ФАТ в качестве одной из связанных жирных кислот.

В последние годы получение клеточных линий, синтезирующих лимфокины, а также развитие методов клонирования кДНК и ее экспрессии в бактериях и других клетках привели к значительному прогрессу в изучении лимфокинов. В настоящее время можно получать белки из двух источников и в количествах, достаточных для проведения биохимических анализов, поэтому сейчас выяснилось, что некоторые формы биологической активности, описанной в предыдущем издании этой книги, относятся к ограниченному количеству молекул (табл. 15). В эксперименте с рекомбинант-ными генами получены биологически активные лимфокины с белковой структурой. Однако природные лимфокины содержат углеводы, которые добавляются к белкам при посттранскрипционном гликозилировании.

Хотя ФИМ, первый из описанных лимфокинов, детально исследован, его очистка, как и клонирование его гена, по-прежнему не достигнуты. Предполагается наличие связи между ФИМ и ИФН-у, так как природный и рекомбинантный ИФН-у обладает активностью ФИМ, а моноклональные антитела к ИФН-у нейтрализуют активность ФИМ.

У мышей ИФН-у тесно связан и не может быть отделен от активности ФАМ, хотя у других видов это возможно. В результате экспрес-

Интерлейкин-1 представляет собой семейство полипептидов с молекулярной массой 17 500, которые продуцируются различными клетками в ответ на инфекцию, травму, токсины или иммунные реакции. В настоящее время две его формы клонированы из макрофагов и известна и полная аминокислотная последовательность. Для их описания используются термины «ИЛ- 1-а» и «ИЛ-1-р». Хотя обе формы ИЛ-1 обладают только 26% аминокислотной гомологией, у них отмечается одинаковый спектр биологической активности. Например, обе формы индуцируют продукцию ИЛ-2 в Т-клет- ках (см. главу 1), вызывают лихорадку (см. главу 19) и увеличивают синтез ПГЕ2 (см. главу 10), коллагена и коллагеназы. В общем виде ИЛ-1 опосредует множество эффектов, связанных с защитой организма от инфекции, с локальной реакцией на травму и последующими процессами восстановления. Тем не менее одним из остающихся без ответа вопросов является вопрос о том, как единичная молекула может обладать столь разнообразными биологическими возможностями. Молекулярное клонирование ИЛ-1 с применением технологии рекомбинантной ДНК дало возможность получать большие количества ИЛ-1. Используя рекомбинантные ИЛ-1, исследователи подтвердили, что данное вещество реально обладает широким спектром биологической активности.

Формы ИЛ-1 (табл. 16)

ИЛ-1 сначала синтезируется в виде молекулы предшественника с молекулярной массой около 31000. Как ИЛ-1-а, так и ИЛ-1-B формируют полипептидную цепь, не имеющую сигнальной пептидной группы, характерной для большинства секретируемых белков и функционирующей как место расщепления крупного предшественника на более мелкие «зрелые» белки, которые затем секретируются. Причина отсутствия сигнального пептида в ИЛ-1 пока неизвестна; предлагаются следующие объясне-

ния: а) эта молекула предназначена скорее для внутриклеточного существования, нежели для транспорта в экстрацеллюлярное пространство; б) отсутствие сигнального пептида указывает на существование древней и примитивной молекулы, возникшей до появления компетентной системы циркуляции; в) внутриклеточный ИЛ-1 высвобождается только при гибели клеток. Получены данные, свидетельствующие в пользу всех трех гипотез. Например, некоторые исследователи показали, что при стимуляции большая часть вновь синтезируемого ИЛ-1 остается внутри клетки; более того, ИЛ-1 часто бывает связанным с внешней клеточной мембраной. Кроме того, количество ИЛ-1, выделяемого во внеклеточную среду, является функцией клеточных пертурбаций или гибели, в том смысле, что более сильные стимуляторы, такие как фагоцитированные частицы, приводят к лизису клеток и выделению большого количества внеклеточного ИЛ-1. Наконец, в подтверждение эволюционного значения ИЛ-1 показано, что молекулы, подобные ИЛ-1 и выделенные из фагоцитов морской звезды, активны и в отношении клеток человека.

ИЛ-1-а является кислым пептидом, обнаруживаемым главным образом в клетках мышей и лишь в небольших количествах-в клет-

Таблица 16. Формы интерлейкина-1

Количество аминокислот в предшественнике ИЛ-1. Количество N-терминальных аминокислот в зрелой форме