Klimnik_Sitnik_mikrobiologiya

частіше для цього слугують методи Романовського-Гімзи (мікроби фарбуються в голубий колір, а ядерна субстанція - в червоний), Здродовського (рикетсії рубіново-червоні, а клітинні елементи - блідо-голубі), негативне контрастування Айзенберга (незафарбовані рикетсії чітко виявляються на голубому фоні).

На поживних середовищах рикетсії не ростуть, їх можна культи­ вувати в організмі лабораторних тварин, у жовтковому мішку курячо­ го зародка, у легенях білих мишей, у кишечнику вошей.

Рикетсії - унікальні прокаріотичні мікроорганізми. У них поєдну­ ються біологічні властивості прокаріотичних живих систем і вірусів. З першими їх єднає типова будова клітини, а з вірусами - те, що вони є облігатними внутрішньоклітинними паразитами, а також ви­ сокий вміст ліпідів у цитоплазмі та клітинній стінці.

Більшість рикетсій непатогенні для людини. Вони паразитують на членистоногих. Однак деякі види здатні викликати важкі захворю­ вання у людей, які називаються рикетсіозами. Серед них висипний тиф, марсельська лихоманка, гарячка Цуцугамуші, Ку-гарячка та інші. Збудниками цих та інших рикетсіозів є Rickettsia provazekii, R. typhi, R. tsutsugamushi, Coxiella burnetii.

Велику роль у передачі та розповсюдженні рикетсіозів відігра­ ють воші, блохи та кліщі.

Хламідії. Хламідії є дрібними, кокоподібними, нерухомими бактеріями. Вони аспорогенні, не утворюють капсул, грамнегативні. Належать до родини Chlamydiaceae. Не ростуть на живильних се­ редовищах, є облігатними внутрішньоклітинними паразитами. Поза клітиною людини вони існують у вигляді маленьких тілець діаметром

50

до 0,3 мкм. Протягом свого життєвого циклу хламідії проходять три стадії існування в клітині, утворюючи елементарні, ініціальні та проміжні тільця. Тривалість циклу розвитку хламідії - 36-72 год.

Хламідії (Chlamydia trachomatis, C. psittaci) здатні викликати небезпечні захворювання у людини: трахому, паховий лімфагранульоматоз, уретрити, кон’юнктивіти новонароджених, бленорею з включеннями, орнітоз, пневмонію, поліартрит, гастроентерит, менінгоенцефаліт.

Мікоплазми. Мікоплазми є аспорогенними прокаріотичними орга­ нізмами, які не мають ригідної клітинної стінки. Вони - поліморфні, сферичні або овоїдні утворення діаметром до 0,2 мкм, однак бувають і клітини діаметром до 1,5 мкм і більше. Мікоплазми не утворюють спор, грамнегативні. Вони мають типову будову бактеріальної кліти­ ни, але в них відсутня клітинна стінка.

Мікоплазми вибагливі до живильних середовищ, вимагаючи до­ давання до них холестеролу, нативного білка, пуринових та піримідинових основ та інших компонентів.

Вони часто зустрічаються в стічних водах, грунті, паразитують в організмі людини і тварин. У людини вони спичиняють пневмонії, бронхіоліти, ангіни, уретрити, простатити, ураження придатків мат­ ки, артрити, ендокардити тощо. Найчастіше захворювання викли­ кають Mycoplasma pneumoniae, M. hominis, Ureaplasma urealyticum.

Патогенні найпростіші. Об’єктом дослідження в мікробіології виступає група еукаріотичних мікроорганізмів, які називаються найпростішими. Вони належать до типу Protozoa і, відповідно, класів саркодових, джгутикових, споровиків та інфузорій.

Найпростіші - високоорганізовані живі системи з усіма функціями, притаманними тваринному організму, розмірами від 2 до 150 мкм.

Будова їх складніша за бактерійну клітину. Вони мають чітко уособлене одне або декілька ядер з каріолемою і ядерцями, цито­ плазму, яка відмежовується пеликулою, особливим видом еластичної мембрани. У них є ендоплазматичний ретикулюм, апарат Гольджі, мітохондрії, лізосоми, різні типи вакуолей як орган травлення. Деякі збудники мають особливі опорні фібрили. Рухаються вони за допомо­ гою псевдоподій, джгутиків або війок.

Найпростіші мають складні цикли розвитку. Здатні розмножува­ тись безстатевим (поділом) і статевим шляхами або їх поєднанням. При несприятливих умовах вони утворюють цисти, які здатні довго зберігатись, не втрачаючи патогенних властивостей.

51

Найпростіші широко розповсюджені у природі. Більшість із них непатогенні для людини. Однак деякі представники мають високоінфекційні властивості та спричиняють амебіаз, трипаносомоз, лейш­ маніоз, урогенітальний та кишковий трихомоноз, токсоплазмоз, ма­ лярію, балантидіаз. Всі ці захворювання характеризуються тривалим і важким перебігом, ураженням численних органів і систем.

Патогенні гриби. Гриби - особлива велика група еукаріотів (понад 100000 видів), широко розповсюджена в природі, а грибкові захво­ рювання (мікози) складають значну частину інфекційної патології людини.

Гриби представляють собою нефотосинтезуючі організми, які рос­ туть у вигляді ниток, що переплітаються та галузяться. їх унікаль­ ність полягає в тому, що вони подібні за деякими ознаками як до тваринних, так і до рослинних організмів. Із тваринним світом їх зближує наявність особливої полісахаридної субстанції - хітину, участь в обміні азоту сечовини, а в обміні вуглеводів - глікогену. Однак за способом живлення - шляхом всмоктування, а не заков­ тування їжі, а також необмеженим ростом, вони нагадують рослини.

Клітини більшості грибів вкриті твердою оболонкою, основу якої складають азотисті та безазотисті полісахарди та целюлоза. Цито­ плазматична мембрана щільно прилягає до внутрішньої поверхні клітинної оболонки. В цитоплазмі міститься чітко диференційоване одне або декілька ядер з ядерцями, центральна вакуоль, мітохондрії, мікросоми, лізосоми, рибосоми, комплекс Гольджі, пластиди, секреторні гранули, різноманітні включення - волютин, солі органіч­ них кислот, фосфатів, солей калію, натрію, заліза, глікоген, пігменти різнобарвних відтінків.

Молоді клітини грибів, як правило, яйцевидні, дещо видовжені, зрілі стають циліндричними, а старі - грушоподібними, булавоподібними, веретеноподібними. Основу тіла гриба становлять особливі трубчасті нитки - гіфи, сукупність яких називають міцелієм. У гіфах нижчих грибів починають з ’являтись перегородки, які є характерною ознакою у вищих грибів. Вони не суцільні, мають пори, через які здійснюється загальний обмін речовин. Кінцеві розгалуження міцелію мають своєрідну форму, за якою можна диференціювати окремі види. Так, гіфи міцелію дерматофітів можуть нагадувати роги оленів, канделябри, спіралі, булаву, гребінь півня тощо.

Розмноження грибів здійснюється безстатевим та статевим шля­ хом, що дозволило поділити їх на дві принципово відмінні групи -

52

недосконалі та досконалі гриби. Вегетативне розмноження здійсню­ ється брунькуванням, кусочками грибниці, спорами, які виникають внаслідок розчленування гіфів міцелію. Спори можуть розміщува­ тись по боках або на кінцях міцелію (екзоспори), часто в особливих утвореннях, які називаються асками або сумками (ендоспори). Статеве розмноження здійснюється шляхом злиття чоловічих та жіночих гамет, внаслідок чого утворюється зигота, яка дає початок новому грибу.

Гриби - аеробні істоти. Для їх живлення необхідні численні азо­ тисті, вуглецевмісні та мінеральні речовини. Вони мають різнома­ нітні ферменти, що використовується для диференціації окремих видів.

Існують різні класифікації грибів, в основу яких покладено їх при­ родну ознаку - будову органів плодоносіння, характер плодових тіл, їх форму, величину, морфологічні особливості.

Виділяють нижчі та вищі гриби. До нижчих належать хітридіоміцети, ооміцети, зигоміцети. До вищих - аскоміцети, базидіоміцети та дейтероміцети.

Нижчі гриби непатогенні для людини. Однак окремі види мукоро­ вої плісняви рідко уражають шкіру, очі, зовнішні слухові проходи, легені, мозкові оболонки, шлунково-кишковий тракт, здатні викликати алергію, професійні оніхомікози та пароніхії у людей, які збирають і обробляють апельсини. Захворювання називаються зигомікозами.

Аскоміцети - клас сумчастих грибів, тому що спори їх зберігають­ ся в особливих сумках - асках, об’єднує понад 300 різноманітних видів. Вони мають міцелій з вираженими перегородками. Патоген­ ними для людини є представники родів Aspergillus, Pénicillium, які викликають відповідно аспергільози та пеніциліози шкіри і внутрішніх органів зовнішніх слухових проходів, а також алергічні реакції.

Велике значення в медичній практиці мають гриби роду Can­ dida. Вони часто є представниками нормальної мікрофлори організму людини. Але при важких хронічних захворюваннях, імунодефіцитах, злоякісних новоутвореннях, нераціональному застосуванні антибіо­ тиків, гіповітамінозах та авітамінозах здатні викликати серйозні захворювання - кандидомікози. Молочниця у новонароджених дітей, заїди в осіб будь-якого віку, системні кандидози з ураженням шкіри, органів дихальної системи та шлунково-кишкового тракту із смер­ тельними випадками - все це спектр дії одних і тих же дріжджоподібних грибів Candida.

53

Великого значення в медичній патології набула група недоско­ налих грибів, дейтероміцетів, до складу якої входить багато видів. Вони мають септований міцелій, їх життєвий цикл відбувається в гаплоїдному стані, без зміни ядерних фаз, статевого шляху розмно­ ження у них ще не описано.

Ця група грибів надзвичайно різноманітна і часто є причиною розвитку в людини важких захворювань - дерматофітій, глибоких мікозів. Серед них найчастіше зустрічаються епідермофітія стоп, мікроспорія, трихофітія, фавус.

Важкий і хронічний перебіг мають у людини такі мікози, як гістоплазмоз, криптококоз, північноамериканський бластомікоз або хвороба Джілкрайста-Стекса, пневмоцистоз у людей із синдромом набутого імунодефіциту та багато інших.

Однак гриби мають і велике корисне значення. їх використо­ вують у харчовій, парфюмерній, хімічній промисловості як проду­ центи різноманітних ліполітичних та інших ферментів. Із представ­ ників родів Pénicillium, Cephalosporium одержують антибіотики (пеніциліни, цефалоспорини).

Матеріали до практичних занять

1. Методи виготовлення мазків та прості методи фарбування

Виготовлення препаратів-мазків з культури, яка виросла на твердому середовищі. Знежирене предметне скельце пропалюють у полум’ї газового пальника і після охолодження кладуть на робоче місце. Бактеріологічну петлю, тримаючи як олівець вертикально у правій руці, прожарюють у полум’ї, спочатку кінець петлі, потім її металеву частину. Не випускаючи петлі, лівою рукою беруть пробір­ ку з 0,9 % розчином хлориду натрію і зажимають ватно-марлеву пробку 4-им і 5-им пальцями правої руки, витягують її, і край пробірки проносять через полум’я пальника. Тримають пробірку на віддалі до 20 см від полум’я, не випускаючи пробки. Петлю вводять у пробірку і охолоджують, торкаючись її стінок. Занурюючи петлю в рідину, набирають краплю фізрозчину. Виймають петлю, проводять край пробірки і пробку через полум’я, після чого її закривають і ставлять у штатив. На центр скельця бактеріологічною петлею нано­ сять краплю фізрозчину. На добре знежиреному скельці вона розті­ кається рівномірно.

54

Знову стерилізують петлю, і в ліву руку беруть пробірку зі ско­ шеним агаром, на якому виросла культура мікроорганізмів. Від­ кривають пробірку із додержанням усіх правил, охолоджують петлю і набирають нею невелику кількість культури. Петлю виймають, а пробірку закривають і ставлять у штатив.

Культуру петлею наносять біля ізотонічного розчину хлориду натрію і, поступово розтираючи його по склу та емульгуючи в крап­ лі, готують тонкий, рівномірний мазок округлої чи овальної форми діаметром 1-1,5 см. Після цього петлю прожарюють і ставлять у штатив.

Виготовлення препаратів-мазків з культури, яка виросла в рідко­ му живильному середовищі. Бактеріологічною петлею набирають краплю рідкого живильного середовища, в якому ростуть мікроор­ ганізми, із додержанням правил стерильності, як описано вище. Торкаються петлею центра предметного скла і роблять рівномірний тонкий мазок.

Якщо для забору матеріалу використовують пастерівську піпет­ ку, то її також тримають у правій руці та прожарюють у полум’ї перед внесенням у пробірку. Тонкий кінчик піпетки після охолоджен­ ня біля стінки пробірки занурюють у рідину, тримаючи верхній кінець її відкритим. Після попадання в піпетку рідкого середовища з мікробами, верхній кінець її закривають вказівним пальцем правої руки, виймають з пробірки, проносять її відкритий кінець і корок через полум’я і закривають.

На поверхню предметного скельця випускають краплю середови­ ща, а піпетку після цього занурюють у посуд із дезинфікуючим розчином, який повинен бути на кожному робочому місці. Стерильною бактеріологічною петлею роблять мазок.

Виготовлення мазків із харкотиння або гною. Стерильною бакте­ ріологічною .петлею або піпеткою набирають досліджуваний мате­ ріал, який наносять на центр знежиреного предметного скла. Іншим предметним склом покривають матеріал так, щоб залишалась віль­ ною 1/3 верхнього та нижнього скла. їх розсувають у сторони. Таким чином одержують два однакових мазки.

Виготовлення мазків із крові. На знежирене предметне скельце біля одного з країв наносять краплю крові. Краєм іншого скельця, яке спеціально відшліфовано, торкаються краплі, тримаючи його під кутом 45°. Швидко і обережно проводять ним у напрямку до дальшого краю, розтираючи краплю по склу. Правильно виготовлений

55

препарат виходить тонким, дещо просвічує та має жовтувате забарвлення.

Виготовлення мазків відбитків з органів лабораторних тварин, які загинули від експериментальної інфекції. Розжареним у полум’ї скальпелем припікають орган, з якого будуть робити мазок. Потім стерильними ножицями, тримаючи орган пінцетом, з цієї ділянки вирізають кусочок тканини. Поверхнею зрізу торкаються предметного скла у 2-4 місцях, роблячи мазок-відбиток.

Виготовлення препаратів для дослідження мікроорганізмів у живому стані. Для цього використовують методи “висячої” та “роздавленої” краплі.

Препарат для “висячої” краплі готують на покривному скельці, на яке наносять краплю бульйонної культури мікроорганізмів. Якщо використовується культура, яка виросла на агарі, спочатку на скель­ це наносять краплю стерильного ізотонічного розчину натрію хлори­ ду, потім у нього стерильною петлею вносять культуру мікробів.

Спеціальне предметне скельце з лункою, края якої попередньо змащені вазеліном, притуляють до покривного скельця з краплею так, щоб вона знаходилась у центрі лунки, і перевертають препарат покривним скельцем догори. Якщо препарат виготовлено правильно, то крапля вільно звисає у лунку, не торкаючись її поверхні.

Для мікроскопування спочатку використовують мале збільшення мікроскопа х8. При опущеному конденсорі для кращого контрастуван­ ня знаходять край краплі, потім встановлюють об’єктив х40 і дослі­ джують препарат.

Препарат “роздавленої” краплі відрізняється від “висячої” тим, що краплю з мікроорганізмами готують на звичайному знежиреному предметному склі, а потім покривають її покривним скельцем, стежачи за відсутністю бульбашок повітря. Умови мікроскопування аналогічні до тих, що використовуються при “роздавленій” краплі.

Після мікроскопії препарати опускають у банку з дезрозчином. Методика виготовлення та забарвлення мазків. Мазок перед забарвленням висушують на повітрі або над полум’ям пальника і фіксують після повного висихання. Фіксацію проводять у полум’ї пальника, тричі проносячи скельце через полум’я стороною, на якій немає мазка. Необхідно стежити, щоб загальний час перебування препарата в полум’ї не перевищував 5-6 секунд. Достатність фіксації можна перевірити, торкнувшись тильною стороною скельця шкіри кисті: скло повинно бути гарячим, але не створювати відчуття опіку.

56

фіксування проводять для того, щоб вбити мікроорганізми і при­ кріпити їх до скла. Вбиті бактерії краще сприймають барвники.

Зафіксований препарат кладуть на спеціальну підставку над лотком, наносять одну-дві краплини барвника. Фарбувати мазок фуксином Пфейффера необхідно 1-2 хв, а лужним метиленовим синім ” 3-5 хв.

Після забарвлення препарат промивають водопровідною водою до зникнення струмочків барвника, висушують фільтрувальним папером і мікроскопують.

У повсякденній мікробіологічній практиці найчастіше використо­ вуються основні барвники: фуксин основний, нейтральний червоний, конго червоний (дають червоне забарвлення), метиленовий та толуї­ диновий синій (голубе, синє), генціанвіолет, метиленовий фіолетовий (фіолетове),* хризоїдин, везувін (жовто-коричневе), брильянтовий зелений, малахітовий зелений (зелене) та інші.

Існуючі методи фарбування можна поділити на прості й складні. При простих використовують один барвник, який надає змогу вияви­ ти, в основному, форму мікроорганізмів.

Практична робота

1.Виготовити мазок з бульйонної культ ури кишкових паличок і забарвити його фуксином Пфейффера.

2.Виготовити мазок з агарової культ ури стафілококів і забарвити його метиленовим синім.

3.Дослідити під мікроскопом порівняльні розміри мікроорганізмів і форменних елементів крові.

4. Демонстрація живих мікроорганізмів у темному полі.

2. Складні методи забарвлення

При складних методах, які ще називають диференціально-діагнос­ тичними, використовують декілька різноманітних барвників, які дозволяють виявити особливості хімічного складу клітини або наяв­ ність у неї певних структур.

Для фарбування беруть розведені водно-спиртові або водно-фено- лові розчини, які готують із насичених розчинів відповідних барвників.

Забарвлення мікроорганізмів за методом Грама« Метод Грама є найважливішим методом забарвлення мікробів і виявлення їх тинкторіальних властивостей. Він дозволяє поділити мікроорганізми на Дві групи: грампозитивні та грамнегативні, хоча в практиці

57

трапляються випадки, коли одні й ті ж бактерії характеризуються як грамваріабельні.

Метод було розроблено Кристіаном Грамом у 1884 р. Однак до цього часу остаточно не з ’ясовано механізми різного забарвлення мікроорганізмів. Вважають, що така здатність пов’язана з відміннос­ тями у будові пептидоглікану в клітинній стінці грампозитивних бактерій, наявністю тейхоєвих кислот, вищою, порівняно з грамнегативними, концентрацією комплексу протеїн-рибонуклеїнат магнію в клітині, співвідношенням РН К:ДНК в цитоплазмі (у грампози­ тивних 8:1, а грамнегативних 1:1), а також більш кислим значенням рН в ізоелектричній точці цитоплазми.

Принцип методу полягає в тому, що клітини грампозитивних бактерій здатні утворювати міцну сполуку з генціанвіолетом та йодом, яка не вимивається з бактерій спиртом, отже, вони забарв­ люються в темно-фіолетовий колір. У грамнегативних бактерій цей комплекс вимивається спиртом, тому вони потім забарвлюються фуксином в червоний колір.

Грампозитивними є стафілококи, стрептококи, пневмококи, сарцини і монококи, бацили і клостридії, а також дифтерійні та тубер­ кульозні палички. Грамнегативні - гонококи, менінгококи, кишкові палички, сальмонели, збудники дизентерії, рикетсії, всі звивисті бактерії та інші.

Методика забарвлення полягає в тому, що на фіксований препарат накладають клаптик фільтрувального паперу, на який наливають карболовий розчин генціанвіолету на 1-2 хв (у модифікації Синьова використовують суху полоску фільтрувального паперу, заздалегідь просочену 1 % спиртовим розчином кристалвіолету і висушену, на яку наливають 2-3 краплі води).

Барвник зливають і, не промиваючи препарат водою, наливають розчин Люголя на 1 хв. Зливають розчин Люголя і знебарвлюють препарат спиртом до зникнення фіолетових струмочків барвника. Промивають його водою і додатково забарвлюють протягом 1-2 хв водним розчином фуксину Пфейффера. Барвник зливають, препарат промивають водою, висушують та мікроскопують (рис. 13, вкл.).

Фарбування кислотостійких мікроорганізмів за методом ЦіляНільсена. Деякі бактерії (збудники туберкульозу, лепри, актиномі­ цети) в цитоплазмі містять багато жироподібних речовин, вищих ненасичених жирних кислот, воскоподібних субстанцій, тому вони погано знебарвлюються сумішшю кислота - спирт або окремо

58

кислотою після забарвлення гарячим розчином карболового фук­ сину. Такі мікроорганізми належать до кислотостійких, а для їх виявлення використовується спеціальний метод забарвлення ЦіляНільсена.

На фіксованй мазок, виготовлений з мокротиння хворого на тубер­ кульоз, кладуть листочок фільтрувального паперу, на який наносять карболовий концентрований фуксин Ціля. Препарат тримають пінце­ том і тричі прогрівають у полум’ї пальника до появи пари, кожний раз остуджуючи і додаючи нову порцію барвника. Папірець знімають, а препарат промивають водою і опускають 2-3 рази в стаканчик з 5 % сірчаною кислотою або наливають цей розчин на мазок для зне­ барвлення. Знову ретельно промивають препарат водою і зафарбову­ ють 3-5 хв розчином метиленового синього, промивають водою, висушують і мікроскопують.

Кислотостійкі палички забарвлюються в рубіново-червоний ко­ лір, інші бактерії та фон - у голубий (рис. 14, вкл.).

Методика виявлення капсул. Виявлення капсул у мікрооганізмів має важливе діагностичне значення. Можна спостерігати капсули у живих бактерій. Для цього краплю суспензії мікробів наносять на предметне скло, додають краплю насиченого 3 % водного розчину конго червоного. Змішавши дві краплі разом, частину суміші наносять на чисте предметне скло і опускають на нього покривне скельце, стежачи за тим, щоб не було повітря. Надлишок рідини відсмоктують фільрувальним папером, придавлюючи скельце до предметного. Внаслідок утворення капілярного шару фарби і розміщення мікро­ організмів в один шар при мікроскопії неімерсійним або імерсійними об’єктивами спостерігають живих бактерій і утворення прозорих ореол капсул навколо них.

За методом Бурріна середину предметного скла наносять краплю туші та змішують її з краплею культури капсульних мікроорганізмів. Роблять мазок шліфованим ребром предметного скла, висушують і мікроскопують. На темному фоні видно й ободок капсули навколо незабарвлених мікробів.

Використовуючи метод Буррі-Гінса мазок роблять за методом Буррі, фіксують метиловим спиртом або полум’ям і після промиван­ ня водою забарвлюють 5-10 хв карболовим розчином фуксину Ціля, розведеним 1:3 або тіоніном. Препарат промивають водою, висушу­ ють і мікроскопують. На темному фоні спостерігають забарвлені в червоний або синій колір мікроорганізми, оточені світлим ободком - капсулою (рис. 15, вкл.).

59