Klimnik_Sitnik_mikrobiologiya

на використанні явища флуоресценції. Так як більшість хвороботвор­ них мікроорганізмів не мають первинної (власної) люмінесценції, їх спочатку фарбують слабкими розчинами спеціальних барвників (флуорохромів), які зв’язуються певними структурами клітин. Із них частіше використовують акридин оранжевий, аурамін, корифосфін, флуоресцеїн. Наприк­ лад, при забарвлюванні дифтерійних паличок корифосфіном, вони набувають жовто-зеле- ного світіння в ультрафіолетовому світлі, збудник туберкульозу при забарвлюванні аурамін-родаміном - золотисно-оранжевого.

Метод люмінесцентної мікроскопії набагато Рис. 3. Мікроскоп чутливіший порівняно з іншими мікроскопіч- люмінесцентний ними дослідженнями. Він дозволяє виявити в матеріалі таку малу кількість збудника, яку іншими методами не знаходять (рис. 3).

Люмінесцентну мікроскопію використовують для виявлення антигенів і антитіл (метод імунофлуоресценції). З її допомогою можна побачити мікроби, які містять певні антигени. Для їх виявлення необхідно мати специфічні люмінесцентні сироватки, які викликають флуоресценцію саме даного антигена. Порівняно із звичайними ме­ тодами світлової мікроскопії, використання люмінесцентних мікро­ скопів має ряд переваг: кольорове зображення, більша контрастність, можливість досліджувати як живі, так і вбиті мікроорганізми. Цей метод можна використати для експрес-діагностики багатьох бакте­ рійних і вірусних захворювань.

Електронна мікроскопія. Можливості світлового мікроскопа об­ межені не якістю лінз, а великою довжиною світлових хвиль (2,8- 0,29 мкм). Частинки менших розмірів знаходяться за межами роз­ дільної здатності світлових мікроскопів. Для дослідження таких дріб­ них об’єктів використовують електронний мікроскоп - високовольт­ ний вакуумний прилад, у якому збільшене зображення отримують за допомогою потоку електронів. Він має високу роздільну здатність і може давати збільшення від 20 тис до 5 млн разів. За принципом дії розрізняють просвічуючі (трансмісивні), скануючі (растрові) й комбіновані електронні мікроскопи.

Принципова схема просвічуючого електронного мікроскопа мало чим відрізняється від схеми світлового. В електронному мікроскопі замість світла використовують потік електронів, джерелом яких є

зо

вольфрамова нитка, що нагрівається електричним струмом (елект­ ронна пушка). Роль лінз виконує кругове електромагнітне поле. Пучки електронів, проходячи через досліджуваний об’єкт, відхиля­ ються під різними кутами залежно від неоднакової товщини й щільності препарату. Це й забезпечує контрастність зображення.

Досліджуваний об’єкт спочатку зафіксовують спеціальними фік­ саторами, потім наносять на надзвичайно тонку колодієву або целюлозну плівку, вміщену на спеціальну сіточку-підкладку. Для визначення деталей структури бактерій чи вірусів застосовують метод напилення або негативного контрастування. При напиленні на поверхню препарату під певним кутом наносять тонким шаром у вакуумі різні важкі метали, хром, золото, паладій. Розпорошені частинки металу осідають на піднесених чи заглиблених ділянках бактерій або вірусів. При дослідженні таких препаратів деталі їх структури проявляються рельєфно і контрастно. Негативне контрас­ тування зводиться до нанесення на препарат розчинів з атомами важких металів, наприклад, фосфорно-вольфрамової кислоти. Осі­ даючи навколо білкових частинок досліджуваного об’єкту й запов­ нюючи всі проміжки між ними, атоми важких металів “забарвлюють”фон, на якому виступають найменші деталі будови мікроорга­

визначити родову належність вірусів, що використовується для експрес-діагностики багатьох вірусних інфекцій.

Практична робота

1.Оволодіти правилами роботи з імерсійною системою мікроскопа.

2.Вивчити під мікроскопом морфологію бактерій в готових препа­ ратах-мазках і замалювати їх .

31

3. Ознайомитись з правилами роботи в мікробіологічній лабораторії.

Питання для самоконтролю

1.Що вивчає наука мікробіологія?

2.Які основні досягнення і завдання мікробіологічної науки?

3.Основні періоди розвитку мікробіологи?

4.Значення робіт А. Левенгука і Е. Дженнера?

5.Вклад Л. Пастера в розвиток і становлення медичної мікробіології.

6.Діяльність Р. Коха - творця бактеріологічної техніки.

7.Значення робіт 1.1. Мечнікова для розвитку вітчизняної і світової мікробіологічної науки.

8.Д.Й. Івановський - основоположник науки про віруси.

9.Вклад українських учених у розвиток мікробіологи.

10.Які правила мікроскопування з імерсійною системою?

32

Розділ 2. МОРФОЛОГІЯ МІКРООРГАНІЗМІВ

Мікроорганізми - загальна збірна назва для найдрібніших організмів. Це найстародавніші живі істоти на Землі. До них належать бактерії, віруси, гриби, найпростіші. Бактерії разом із водоростями складають царство прокаріотів; віруси - неклітинні форми життя, які мають власний геном і відтворюються тільки в клітинах; найпростіші та гриби - одноабо багатоклітинні еукаріотичні організми.

Класифікація й номенклатура бактерій

Одна з перших спроб наукової класифікації бактерій належить датському зоологу О. Мюллеру, який ще у XVIII ст. виділив два роди - Monas і Vibrio. Пізніше німецький біолог Е. Геккель запропону­ вав виділити мікроби в окреме царство Protista (protos - найпрості­ ший). Воно охоплювало переважно одноклітинні мікроорганізми. По­ дальші дослідження привели до поділу цього царства на вищі (водо­ рості, гриби, найпростіші) і нижчі (бактерії, ціанобактерії) протисти. Такий підхід сприяв чіткому поділу живого світу на прокаріотичні та еукаріотичні живі системи.

Сучасна систематика (таксономія) бактерій - наука про їх розпо­ діл за певними групами (таксонами). Для їх характеристики врахову­ ють різноманітні властивості: морфологічні ознаки, здатність спожи­ вати атмосферний кисень, шляхи одержання енергії, оптимальна температура росту, pH середовища, здатність засвоювати певні ре­ човини, наявність включень, склад клітинної стінки, вміст основ ДНК, екологічна ніша тощо.

Для назви мікроорганізмів використовують подвійну номенклату­ ру К. Ліннея. Перше слово вказує на рід і пишеться з великої літери. Воно походить від прізвища вченого, який відкрив і вивчав даний мікроорганізм, або характеризує якусь морфологічну ознаку. Друге слово означає вид, пишеться з малої літери і пов’язане з назвою хвороби, прізвищем автора та ін. Так, стафілокок золотистий має назву Staphylococcus aureus, збудник туберкульозу - Mycobacte­ rium tuberculosis, кишкова паличка - Escherichia coli.

Найбільше визнання серед мікробіологів отримала класифікація мікроорганізмів, яка подана у Визначнику бактерій Д. Бергі (Bergey’s Manual Systematic Bacteriology).

33

Основною таксономічною категорією є вид - група близьких між собою організмів, які мають спільне походження, єдиний генотип, подібні морфологічні, фізіологічні, біохімічні, серологічні, екологічні та інші ознаки.

Відповідно до Міжнародного кодексу номенклатури бактерій мік­ робіологи використовують такі таксономічні критерії систематики:

вид - рід - родина - порядок - клас - відділ - царство.

Відповідно до неї царство Procaryotae поділено на 4 відділи за особливостями будови клітинної стінки, відношенням до фарбування за методом Грама та ін.: Gracilicutes (gracilis - тонкий, cutis - шкіра) - грамнегативні бактерії, Firmicutes (firmus - міцний) - грампозитивні бактерії, Tenericutes (tener - м’який, ніжний) - мікроби, які не мають клітинної стінки, Mendosicutes (mendosus - помилковий) - пред­ ставники мікробного світу, що мають нетиповий пептидоглікан.

Згідно з цим визначником усі мікроорганізми поділені на 33 групи за ознаками, які винесено у назву групи: 1 - спірохети, 4 - грамнега­ тивні аеробні палички й коки, 12 - грампозитивні коки, 13 - грам­ позитивні палички й бактерії, що утворюють спори, тощо. Всередині груп поділ мікробів відбувається на порядки, родини, роди, види.

Однак генетичні механізми, що лежать в основі мінливості, здатні забезпечувати тільки відносну стабільність ознак в межах одного ви­ ду, тому введено поняття про варіанти (типи) бактерій, які за де­ якими особливостями відрізняються від стандартних видів: морфовари (за морфологічними ознаками), біовари (за біологічними), ферментовари (за ферментативними), фаговари (за чутливістю до бактеріофа­ гів), серовари (за антигенними властивостями), ековари (за екологіч­ ними нішами помешкання), патовари (за патогенністю для лаборатор­ них тварин).

Існує таке важливе поняття як “штам” - сукупність мікробних особин одного виду, які виділено з різних джерел (організму людини, тварини, зовнішнього середовища), або з одного джерела, однак у різний час.

У популяційну мікробіологію введено поняття “клон” - нащадки однієї мікробної клітини.

34

Морфологія і ультраструктура бактерій

Зовнішній вид мікроорганізмів напрочуд різноманітний. За формою бактеріі поділяють на кокоподібні, паличкоподібні, звивисті та

Диплококи (сІІрІООБ - подвійний) - група коків, які після поділу не розходяться, а існують парами. Типовими представниками є збудники епідемічного цереброспінального менінгіту та гонореї. Ці мікроорганізми мають характерну бобовоподібну форму і в мазках увігнутими сторонами повернуті один до одного. Збудники крупозної пневмонії та деяких інших гнійно-септичних процесів також належать до диплококів, але мають ланцетоподібну форму або форму полум’я свічки.

Стрептококи (зітери^ - намисто) - мікроби, які після поділу в одній площині не розходяться, а формують ланцюжки, що склада­ ються з 3-4, а деколи й десятків клітин круглої або еліпсоподібної форми. Частина їх є сапрофітами, представниками нормальної

35

мікрофлори людини, інші викликають важкі гнійно-септичні процеси (пневмонію, менінгіт, остеомієліт, холецистит, сепсис тощо). Доказана роль стрептококів у розвитку скарлатини, ревматизму, бешихи.

Тетракоки (tetra - чотири) - коки, які після поділу у двох взаємно перпендикулярних площинах утворюють тетради. Як правило, ці мікроорганізми непатогенні для людини.

Сарцини (sarcina - пака, тюк) - коки, у яких поділ відбувається в трьох взаємно перпендикулярних площинах, а після поділу вони не розходяться і розташовуються у вигляді паків з 8, 16, 32, 64 клітин. Патогенних представників серед них немає.

Стафілококи (staphyle - гроно) - коки, які діляться в декількох площинах, клітини розташовуються хаотично, у вигляді скупчень, що в мазках із чистої культури нагадують виноградне гроно. Стафі­ лококи - убіквітарні мікроби, зустрічаються в повітрі, грунті, організмі людини і тварин. Чисельні їх представники спричиняють різноманітні гнійно-септичні захворювання: фурункул, карбункул, гідроаденіт, флегмону, нефрит, холецистит, менінгіт, пневмонію, сепсис тощо. Практично в організмі людини немає органів і тканин, які не ушкоджуються стафілококами.

Не менш дивовижний світ паличкоподібних або циліндричних бактерій, які за своєю кількістю перевищують кокові мікроорганізми. Середні розміри їх 0,5-1,5 мкм завдовжки і 0,5-2 мкм завширшки.

Паличкоподібні бактерії мають різноманітну форму (циліндричну, еліпсоподібну, овальну, веретеноподібну, у вигляді барабанної па­ лички або тенісної ракетки). їх кінці можуть бути рівні або нібито обрублені й навіть увігнуті (збудник сибірки), заокруглені (кишкові палички, збудники черевного тифу, дизентерії). Зустрічаються па­ личкоподібні форми із загостреними кінцями (фузобактерії), булавоподібними потовщеннями на них. Часто трапляються мікроби, що мають розгалуження (мікобактерії туберкульозу). Це дозволяє роз­ пізнавати вид мікроорганізмів, що має велике значення при лабора­ торній діагностиці.

Паличкоподібні бактерії, залежно від здатності утворювати спори та їх діаметру, поділяють на власне бактерії, бацили і клостридії.

Власне бактерії - мікрооганізми, які не здатні до утворення спор. До них належать збудники сальмонельозів, черевного тифу, дифтерії, туберкульозу, кашлюка.

Бацили (bacillus - паличка) і клостридії (closter - веретено) здатні утворювати спори. До першої групи належать збудники сибірки, до другої - збудники газової анаеробної інфекції, правця, ботулізму.

36

За аналогією з коками, залежно від способу розташування у мазках, паличкоподібні мікрооганізми поділяють на: а) монобактерії (кишкова, черевнотифозна, дизентерійна палички, збудник чуми) і монобацили (збудники правця, ботулізму); б) диплобактерії (клебсієли пневмонії) і диплобацили; в) стрептобактерії (збудники м’якого шанкру) і стрептобацили (збудники сибірки).

Спіралеподібні бактерії мають звивисту, штопороподібну фор­ му. До цієї групи бактерій належать вібріони, спірили, спірохети (рис. 5).

Вібріони (уіЬгаге - коливатись, тремтіти) - бактерії, з одним не­ великим вигином розміром 1/4 завитка спіралі, що надає їм схожість із комою. Представниками цієї групи є збудники холери і холеро­ подібні вібріони, які населяють водоймища.

Спірили (Бріга - завиток, спіраль) - бактерії, які мають декілька вигинів, що надає їм форму штопора. Патогенним представником є спірила, яка викликає у людини содоку (хворобу укусу щурів). До цієї групи мікроорганізмів належать також кампілобактерії та гелікобактерії, які здатні спричиняти у людини захворювання шлунково-кишкового тракту, сечостатевої системи.

Спірохети (Бреіга - виток, Иаіїе - довге волосся) також мають штопороподібну форму і розрізняються між собою числом завитків і довжиною (довжина може сягати 500 мкм, а діаметр збудників - 0,3-1,5 мкм). Серед них виділяють патогенні для людини трепонеми (Ігеро - повертати, пето - нитка), борелії (за прізвищем французь­ кого бактеріолога А. Боррела) і лептоспіри ( Іе р ^ - тонкий, ніжний). Трепонеми викликають у людини сифіліс, лептоспіри - лептоспіроз, борелії - поворотний тиф. Існує велика група непатогених спірохет (власне спірохети, сапроспіри, кристиспіри).

Ниткоподібні бактерії для людини непатогенні. Тіобактерії та залізобактерії є мешканцями грунтів, водоймищ, беруть участь у процесах кругообігу речовин у природі. До цієї групи мікроорганізмів можна віднести й актиноміцети, які здатні викликати у людини тяжкі захворювання - актиномікози.

Описані морфологічні форми бактерій не обмежують існування мікробного царства. Деякі його представники можуть нагадувати кільце, шестикутну зірку, набувати червоподібної форми. Це, в основ­ ному, вільноживучі мікроорганізми, які беруть участь у процесах біодеградації різноманітних природних сполук Патогених представників серед них немає, і в курсі медичної мікробіології вони не розглядаються.

37

Ультраструктура бактеріальної клітини. Бактеріальні клітини є прокаріотичними живими системами. Між ними та еукаріотами (еи - справжній, karyon - ядро) існують суттєві відмінності, які дозволяють віднести представників мікробного світу до єдиного царства. Слід пам’ятати, що в еукаріотів тканини та органи складаються з окремих клітин, що знаходяться у фізіологічній метаболічній залежності і не можуть існувати окремо. Мікробна клітина - абсолютно автономний складний організм, здатний до самостійного, індивідуальнго існування.

Найсуттєвішою ознакою прокаріотів є відсутність ядра. Його роль відіграє нуклеоїд - ядерна речовина, яка дифузно розташована в цитоплазмі та не відмежована від неї каріолемою. Нуклеоїд клітини складається з однієї нитки ДНК, замкненої в кільце, гістоноподібні білки та ядерце відсутні. У бакте­ рій немає таких органел, як мітохондрії, апарат Гольджі, ендоплаз­ матичний ретикулюм, хлороплас­ ти, мікротільця. Проте вони мають мезосоми, функція яких аналогічна мітохондріальній. Константа седи­ ментації мікробних рибосом складає 70S, в той час як в еукаріотів - 80S. Існують також суттєві відмін­ ності за будовою джгутиків, наяв­

ністю вакуолей тощо.

ральну частину, має неправильну форму і не відмежовується від цитоплазми оболонкою, поєднується з цитоплазматичною мембраною і мезосомою. Він складається з однієї суперспіралізованої подвійної нитки ДНК діаметром до 2 нм, замкнутої в кільце, інтегрованої з РНК, РНК-полімеразою та білком у співвідношенні 1:1:3. Довжина цієї гігантської молекули може сягати до 1,5-3 мм. Молекулярна

38

маса нуклеоїда - (І-З)хІО9 дальтон, і містить він до 8x10е пар нуклеїнових основ. Вміст пар основ А+Т і Г+Ц в молекулі кожної клітини є постійним для певного виду бактерій, а частка Г+Ц у загальній молекулярній масі становить 23-75 %.

Як правило, в клітині нуклеоїд представлено однією копією, проте під час поділу клітини число цих копій може збільшуватись

до 2-9.

Досить часто бактерії поруч із хромосомною містять позахромосомну ДНК значно менших розмірів, також скручену в кільце і локалізовану в цитоплазмі. Такі елементи одержали назву плазміди. Вони детермінують синтез деяких речовин, ферментів, забезпечу­ ють стійкість бактерій до антибіотиків, отже, надають їм певних селективних переваг.

Ядерну субстанцію мікробів можна виявити в ультратонких зрізах при дослідженні їх в електронному мікроскопі, за допомогою імунофлуоресцентної, радіоімунної мікроскопії, радіоавтографії, а також забарвлюючи її за методами Робіноу-Фельгена, Пікарського тощо.

Цитоплазма бактерійних клітин має рідку консистенцію, прозора, гомогенна, відмежовується від зовнішнього середовища цитоплазма­ тичною мембраною. Вона є своєрідною колоїдною системою, що скла­ дається з різноманітних молекул білків, ліпідів, води, ДНК і РНК, вуглеводів, полісахаридів та інших сполук. В’язкість її у 800-8000 разів перевищує аналогічний показник води. Будова і консистенція цитоплазми залежить від віку мікроба - гомогенна у молодих клітин вона поступово перетворюється на дрібнозернисту структуру в старих, набуваючи вигляду щільників. У ній з’являються вакуолі, во­ локнисті утворення, збільшується її густина, за консистенцією вона нагадує гель.

При ультрацентрифугуванні цитоплазми можна одержати “роз­ чинну” фракцію, до якої входять різноманітні ферменти, і фракцію “часток” з мембран та рибосом. Рибосоми виконують роль фабрики синтезу білка, їх розмір досягає 16x18 нм. Складаються вони з двох білкових субодиниць 308-508. Клітина може містити до 5000-50000 рибосом, число їх збільшується при активному синтезі білка. Часом рибосоми збираються у скупчення, які називають полірибосомами

або полісомами.

Відмінності між рибосомами еукаріотичних та прокаріотичних організмів мають вирішальне значення у пошуках шляхів боротьби

39