ЗАНЯТИЕ 13
|
Тема занятия: Иммунитет. Взаимодействие антигена с антителом in vitro. Серологические реакции, их механизм. Прямые серологические реакции. Реакции агглютинации, преципитации. Учебная цель занятия: Познакомиться с основами иммунодиагностики инфекционных заболеваний, антигенами и их свойствами, антигенной структурой бактериальной клетки, взаимодействием антигена с антителом in vitro, с механизмами серологических реакций, постановкой реакций агглютинации и преципитации. Задачи занятия: Освоить методику постановки реакции агглютинации на стекле и в пробирках, реакции кольцепреципитации. Антигены Антигенами называются вещества, несущие признаки генетически чужеродной информации и при введении в организм вызывающие развитие специфических иммунологических реакций. Природными антигенами являются белки, полисахариды, мукополисахариды, липополисахариды, высокомолекулярные препараты нуклеиновых кислот. Антигены бактерий Среди бактериальных антигенов различают структурные, непосредственно связанные с клеткой, и секретируемые во внешнюю среду. В соответствии с принадлежностью антигенов к определенным структурам бактериальной клетки различают следующие их виды:
Корпускулярными антигенами называются антигены, связанные с бактериальной клеткой, либо с другими нерастворимыми частицами, например, эритроцитами. Выделяют также растворимые антигены, например, сывороточный альбумин. К секретируемым (растворимым) бактериальным антигенам относятся экзотоксины и экзоферменты, в том числе, ферменты агрессии. Антитела Антителами называются белковые молекулы, способные к специфическому связыванию с антигенными детерминантами. Антитела относятся к гамма-глобулинам. Другое название антител – иммуноглобулины. Серологические реакции Реакция антиген-антитело представляет собой специфическое взаимодействие антигена с антителом. Продуктом этой реакции являются иммунные комплексы. Реакции антиген-антитело, происходящие in vivo – это важнейший защитный механизм устранения чужеродных антигенов из организма. Серологическими реакциями называются реакции антиген-антитело, происходящие in vitro (в пробирке). Они используются для количественного и качественного определения антигенов и антител в исследуемом материале. При постановке серологических реакций учитывают следующие условия: наличие изотонического раствора (электролита), реакция рН близкая к нейтральной и температура среды (от 20 до 37 ° С). Серологические реакции применяются с целью решения следующих задач:
Таким образом, в серологических реакциях один из двух основных компонентов (АГ или АТ) всегда должен быть известным. Серологические реакции подразделяются на прямые и непрямые. В прямых серологических реакциях участвуют только антигены и антитела. Результат прямых серологических реакций наблюдается непосредственно по изменению оптических свойств раствора (образование хлопьев, помутнения, опалесценции). К прямым серологическим реакциям относятся реакции агглютинации и преципитации и флоккуляции. В непрямых серологических реакциях для визуализации результата взаимодействия антигенов и антител используются индикаторные системы. К непрямым серологическим реакциям относятся реакция связывания комплемента, реакция непрямой гемагглютинации, реакция нейтрализации токсина антитоксической сывороткой, и др. Реакция агглютинации (РА) Агглютинацией называется склеивание бактерий в результате взаимодействия с ними специфических AT. Для проведения РА необходимы три компонента: 1) АГ (агглютиноген); 2) AT (агглютинин); 3) раствор электролита (изотонический раствор хлорида натрия). В реакции агглютинации принимают участие только корпускулярные антигены (бактерии, эритроциты, нагруженные антигеном частицы латекса). Реакция агглютинации на стекле. На обезжиренное предметное стекло пипеткой наносят каплю диагностической сыворотки (разведение сыворотки 1:10 - 1:20). Бактериологической петлей берут чистую культуру исследуемого микроорганизма с поверхности скошенного агара, переносят в каплю сыворотки и перемешивают. Результат реакции учитывают невооруженным глазом через 3-5 мин. При положительной реакции в капле сыворотки отмечают появление хлопьев (крупных или мелких), хорошо видимых на темном фоне при покачивании предметного стекла. В случае отрицательной реакции жидкость остается равномерно мутной. Реакция агглютинации в пробирках. В ряд пробирок вносят по 1 мл физиологического раствора. В первую пробирку прибавляют равный объем исследуемой сыворотки крови. Готовят последовательные двукратные разведения сыворотки (титрование сыворотки), после чего в каждую пробирку вносят по 2 капли взвеси инактивированных бактерий (диагностикум). Пробирки помещают на 2 ч в термостат при 37 °С. Реакция протекает с образованием мелких хлопьев, невидимых невооруженным глазом, поэтому учет результатов проводят под небольшим увеличением в специальном приборе – агглютиноскопе. Интенсивность агглютинации учитывают по системе «четыре плюса»: полная агглютинация - 4+, частичная агглютинация - 3+ или 2+, сомнительный результат - +. За титр антител в исследуемой сыворотке принимают последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация на 2+. Реакцию агглютинации в пробирках (развернутая реакция агглютинации) проводят для определения титра антител к возбудителям брюшного тифа и паратифов (реакция Видаля), бруцеллеза (реакции Райта), сыпного тифа (реакция Вейгля). Реакция преципитации (РП) Реакцией преципитации называется осаждение из раствора АГ (преципитиногена) при воздействии на него иммунной сыворотки (преципитина) в растворе электролита. Осадок представляет собой макромолекулярный иммунный комплекс (преципитат). Выпадение нерастворимого комплекса антиген-антитело в виде осадка наблюдается лишь при эквивалентных соотношениях ингредиентов – в зоне эквивалентности. Зоной эквивалентности называется область, в которой все антитела количественно связаны с антигеном. При избытке антигенов или антител образовавшийся осадок растворяется. В реакции преципитации принимают участие только растворимые антигены (экстракты из микроорганизмов, органов и тканей, продукты распада клеток микроорганизмов — лизаты, фильтраты и т.д.). Антитела способные вызывать преципитацию антигена должны иметь не менее двух валентностей. Преципитирующие сыворотки изготавливают путем гипериммунизации животных (кроликов). Реакция кольцепреципитации. В пробирку наливают 1,0 мл неразведенной преципитирующей сыворотки. Пипеткой медленно наслаивают по стенке пробирки (пробирку держат в наклонном положении) АГ в таком же объеме. Затем пробирку осторожно, чтобы не смешать жидкости, ставят вертикально. При правильном наслоении АГ на сыворотку четко видна граница между двумя слоями жидкости. Результаты реакции учитывают через 1-2 минуты. В случае положительной реакции в опытной пробирке на границе между сывороткой и исследуемым экстрактом появляется преципитат в виде белого кольца. С помощью РП можно выявить не только видовую, но и групповую специфичность белка. Например, определить степень родства различных видов животных и растений. В судебной медицине РП используется для определения видовой принадлежности белка (сыворотки крови). Применение РП для санитарно-гигиенического контроля пищевых продуктов позволяет выявить фальсификацию мясных, рыбных, мучных изделий, примеси в молоке и т.д. Недостатками РП является нестойкость преципитата (кольца), который исчезает даже при легком встряхивании, а также невозможность установить количество разных АГ, участвующих в формировании преципитата. Этих недостатков лишены реакции преципитации в геле. К ним относятся реакция иммунодиффузии по Оухтерлони, и реакция радиальной иммунодиффузии по Манчини. Реакция встречной иммунодиффузии по Оухтерлони. Метод иммунодиффузии основан на встречной диффузии антигена и антител в агаровом геле. Для постановки реакции расплавленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку, после затвердевания в нем вырезают лунки диаметром 2-3 мм, которые заполняют антигеном или сывороткой. Антиген и антитела диффундируют навстречу друг другу и в месте контакта в эквивалентных соотношениях образуют линии преципитации, в виде белой полосы. Реакция радиальной иммунодиффузии по Манчини. При постановке реакции радиальной иммунодиффузии по Манчини в расплавленный агар вносят иммунную сыворотку. После застывания геля в нем делают лунки, в которые помещают антиген. Антиген, диффундируя в гель, взаимодействует с антителами, присутствующими в агаре. В результате образуется радиальная зона преципитации, диаметр которой пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют для количественного определения содержания в крови иммуноглобулинов различных классов. Реакция флоккуляции Реакцией флоккуляции называется появление опалесценции или хлопьевидной массы при добавлении в пробирку с токсином (анатоксином) антитоксической сыворотки. Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина. Самостоятельная работа:
Контрольные вопросы по теме занятия:
Литература для подготовки к занятию: Основная литература:
Дополнительная литература:
|