Pavlovich-_obschy_praktikum

У коринебактерий дифтерии легко выявляются гранулы волютина вследствие высокой концентрации в них метафосфатов. При окраске щелочным метиленовым синим по Леффлеру они приобретают темно-синий цвет, а палочка - голубой. При специальном методе окраски по Нейссеру гранулы волютина - сине-черные а бактерия - желтая. При этом мазок: 1) окрашивают 1 мин уксуснокислым метиленовым синим (метиленовый синий - 0,1 г, спирт 2 мл, ледяная уксусная кислота - 5 мл, дистиллированная вода 100 мл), сливают краситель, промывают водой; 2) наливают раствор Люголя на 20 - 30 с; 3) окрашивают 1-3 мин везувином (кипяченая и отфильтрованная взвесь 2 г везувина в смеси 60 мл 96 % спирта, и 40 мл дистиллированной воды), после чего препарат промываю: водой и высушивают.

Оболочка. Состоит из клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, прилегающей к внутренней ее поверхности. В клеточной стенке имеются три слоя: наружный (липопротеидный), средний (липополисахаридный) и внутренний (ригидный, содержащийщий мукополимеры). Она проницаема для солей. В концентрированном растворе поваренной соли или сахара оболочка отслаивается от обезвоженной цитоплазмы. Это явление получило название плазмолиза.

Цитоплазматическая мембрана также трехслойна: наружный внутренний - протеиновые, а средний - липидный. Содержит ферментные системы, принимающие участие в синтезе белка, токсинов, нуклеиновых кислот, выполняет функцию разделительной перегородки, через которую осуществляется транспорт различных веществ и ионов. В ней локализованы высокочувствительные рецепторы, дифференцирующие вещества, и различные антибактериальные соединения.

Капсула. Это мощный слизистый слой из полисахаридов или протеинов, образующийся у некоторых бактерий вокруг клеточной стенки (см. рис. 32). Одни виды (пневмококк, бациллы сибирской язвы, возбудители чумы, туляремии) образуют капсулы только в организме животного и человека, другие (клебсиеллы пневмонии, озены и риносклеромы) формируют их

ина питательных средах.

Вцелом говоря, микрокапсулу способно образовывать большинство патогенных видов бактерий, преимущественно те из них, которые имеют очень малые размеры (коккобактерии), но обнаружить их под иммерсионным микроскопом невозможно, В организме человека и животных капсулы защищают патогенные бактерии от фагоцитоза, антител и других микробоцидных веществ сыворотки крови. В частности, субстанции капсульных бактерий имеют свойства агрессинов и способны ингибировать фагоциты. При обычных методах окраски капсулы не выявляются, так как не воспринимают каких-либо красителей. Для их выявления используют специальные методы окраски - Бурри-Гинса и Книги.

Обнаружение капсул бактерий по Бурри-Гинсу: в каплю туши, разведенную водой в

10 раз, вносят исследуемые бактерии и равномерно распределяют их петлей по предметному стеклу. Мазок высушивают, фиксируют (наносят 2-3 капли спирта и сжигают его на стекле), окрашивают в течение 3-5 мин фуксином Пфейффера, промывают водой, высушивают. На темном фоне препарата капсулы видны в виде светлых ореолов вокруг красных бактерий.

Окраска капсул по методу Книги. На обезжиренное предметное стекло наносят каплю неразведенной нативной сыворотки, к ней добавляют каплю суточной бульонной культуры бактерий и тщательно перемешивают. Ребром шлифованного предметного стекла делают тонкий мазок. После высушивания его в течение 5 мин фиксируют метиловым спиртом, окрашивают 1 мин 1 % феноловым раствором генцианового фиолетового, разведенным 1:10, и промывают водой. По сравнению с интенсивно окрашенными в фиолетовый цвет бактериями капсулы-ореолы имеют едва видимый фиолетовый оттенок.

Жгутики. Это очень тонкие, но достаточно длинные (0,02x5 -10 мкм), органоиды движения у некоторых видов бактерий, состоящие из фибриллярного сократительного белка - флагеллина. По их количеству и расположению подвижные бактерии разделяют на моно-, протравой.

Окраска жгутиков по Леффлеру. Приготовленную впрок протраву, состоящую из 1 мл насыщенного спиртового раствора основного; фуксина, 10 мл 20 % водного раствора танина, 5,5 мл насыщенное на холоду водного раствора сульфата закисного аммиачного железа (соль Мора), перед

11

употреблением фильтруют. Препарат делают на" покровном стекле, фиксируют и помещают на часовое стекло, наливают протраву и в течение 30 - 50 с подогревают до отхождения паров. После остываниястеклапромываютводой, помещаютнадругое часовое стекло, красят фуксином Циля 2-3 мин при слабом подогревании, промывают, высушиваютимикроскопируют.

Косвенно о наличии жгутиков у бактерий судят, исследуя интактнуюкультуру. Дляэтого: 1) на середину предметного стекла наносят каплю суточной бульонной культуры бактерий и осторожно накрывают ее покровным стеклом так, чтобы жидкость не растекалась за его края и в нее не попадали пузырьки воздуха ("раздавленная" капля), или 2) ту же каплю бактерий наносят на середину покровного стекла и накладываютна него специальное предметное стекло с углублением, смазанным вокруг вазелином, так, чтобы капля находилась в центре лунки. Препарат осторожно переворачивают и капля "свисает" в герметически закрытой полости ("висячая" капля).

"Раздавленную" и "висячую" капли микроскопируют, слегка затемняя поле зрения посредством опущения конденсора, регулируя поступление света вогнутым зеркалом. Вначале пользуются малым увеличением (объектив х 8), после того как обнаружат край капли, устанавливают объектив х 40 или иммерсионный. Более наглядные результаты получают при микроскопиивтемномполезрения или вфазовом контрасте.

Эндоспоры. У бацилл и клостридий они образуются в неблагоприятных условиях внешней среды. Спорообразование у них - одна из стадий цикла развития, и возникает она в процессе старения культур в питательных средах. Споры имеют округлую или овальную форму. Расположены они внутри бактерий, обычно по одной в клетке. У клостридий диаметр эндоспор часто превышает поперечник. Располагаются споры у бацилл центрально, у клостридий - субтерминальноилитерминально.

По сравнению с вегетативными клетками споры обладают высокой устойчивостью к действию неблагоприятных факторов. Они кислотоустойчивы и с трудом воспринимают красители. Объясняется это наличием плотной многослойной оболочки, небольшой концентрацией свободной

.воды и высоким содержанием липидов. В препаратах, окрашенных простыми способами или по Граму, споры остаются бесцветными. Окрашивание их осуществляют специальными методами по Пешкову илиШефферуФультону.

Способ Пешкова. На фиксированный мазок наливают метилено-вый синий по Леффлеру. Нагревают препарат в средней части пламени, кипятят 15 - 20 с, не допуская высыхания. Остывший препарат промывают водой, докрашивают 30 с 0,5 % раствором нейтрального красного, затем снова промывают водой и высушивают. Споры окрашиваются в голубовато-синий цвет, тело бацилл и клостридийврозовый.

Окраска спор по Шефферу - Фулътону. Фиксированный мазок окрашивают 5 % водным раствором малахитового зеленого, 3 - 4 раза нагревая его до появления паров, промывают водой и докрашивают 0,5 % водным раствором сафранина. Споры окрашиваются в зеленый цвет, тело бактерий - в красный.

Шаровидныеипалочковидныескотобактерии

Описание бактерий, как и других прокариот, проводят по определенной схеме. Отмечают: 1) способность окрашиваться, в частности по Граму; 2) форму, размер и характер их расположения в мазке; 3) жгутикование, образование капсул и спор, наличие включений. Различают грамположительные и грамотрицательные шаровидные, палочковидные и изогнутые формы бактерий.

Морфология кокков. Шаровидные бактерии называются кокками. Средний диаметр патогенных кокков около 1 мкм. В зависимости от расположения в мазке патогенные кокки подразделяют на диплококки (греч. diploos - парные), стрептококки (греч. streptos -цепочные) и стафилококки (staphyle - гроздевидные). Диплококки и стрептококки делятся в одной плоскости, но соединяются между собой цитоплазматическими мостиками. Стафилококки делятся в разных плоскостях и образуют скопления клеток, напоминающие грозди. Стафилококки - круглые, стрептококки - овальные, диплококки - бобовидные. Спор и жгутиков патогенные кокки не образуют. Капсулы имеют лишь S. pneumoniae. Стафилококки и стрептококки - грамположительные, диплококки - грамотрицательные.

Морфология бактерий-палочек. Большинство патогенных палочковидных бактерий овоидной формы. Исключение составляют цилиндрические бациллы сибирской язвы, веретенообразные клостридий, булавовидные коринебактерии и микобактерии туберкулеза.. Длина коккобактерий колеблется от 0,2 до 1,5 мкм, а самых больших - бациллы и клостридий - от 5 до 10 мкм. Обычно бактерии-палочки имеют однообразное гомогенное строение. Располагаются

12

они, как правило, беспорядочно, попарно, в длину (капсульные клебсиеллы) или под углом, образуя фигуры в виде X или Y (коринебактерии дифтерии, микобактерии туберкулеза), а некоторые - цепями (возбудители сибирской язвы). Многие палочковидные бактерии имеют жгутики и капсулы, а бациллы и клостридии - споры. Коккобактерии и палочки длиной 1,5-3,0 мкм и шириной 0,3-0,5 мкм окрашиваются грамотрицательно. Бациллы, клостридии, корине- и микобактерии, размеры которых больше средних палочек, грамположительны.

Морфология изогнутых бактерий. Типичные представители этого рода бактерий - вибрионы (лат. vibro - извиваюсь). Холерный вибрион, например, имеет форму изогнутой палочки в виде запятой (3 - 4 х 0,3 мкм) с полярным жгутиком. Спор и капсул вибрионы не образуют. В мазке они напоминают паутинку, окрашиваются грамотрицательно.

Контрольные вопросы

1.Строение и химический состав нуклеоида бактериальной клетки. 2. С помощью каких методов дифференцируют нуклеоид? 3. Структура цитоплазмы бактерий. Основные ее включения. 4. Методы выявления гранул волютина. 5. Строение и функции клеточной стенки и цитоплазматической мембраны. 6. Капсула и методы ее обнаружения. 7. Структура и функция жгутиков бактерий, методы их выявления. 8. Методика приготовления "висячей" и "раздавленной" капли. 9. Эндоспоры бактерий и методы их окраски. 10. Морфология кокков. 11. Морфология бактерий-палочек. 12. Схема исследования морфологии бактерий.

Задания для самостоятельной работы

1. Изучение нуклеоида в готовых препаратах бактерий, окрашенных по Фельгену. 2. Изготовление препаратов из культуры клебсиелл пневмонии для обнаружения капсул и окрашивание их по методу Гинса или Книги. 3. Окраска готовых мазков из дифтерийных коринебактерии по Нейссеру и уксуснокислым метиловым фиолетовым. 4. Приготовление и окраска препаратов из культур антракоида по Пешкову или Шефферу — Фультону. 5. Микроскопирование бактерий со жгутиками (демонстрация). 6. Изготовление препаратов "раздавленная" и "висячая" капли. Демонстрация подвижности бактерий в темнопольноми фазово-контрастном микроскопе.

Актиномицеты

Актиномицеты представляют собой одноклеточные грамположительные бактерии. Клетки их очень разветвлены и напоминают мицелий грибов, размеры их колеблются в пределах 7-100 мкм и более х 0,5 - 1,5 мкм (рис. 5а). Жгутиков, капсул и эндоспор не имеют.

Мазки из культуры на плотной среде готовят следующим образом. Препаровальной иглой отделяют небольшой участок вросшей в среду колонии и помещают в каплю воды на предметном стекле, покрывают его вторым стеклом и, прижимая, раздавливают мицелий. Таким же способом размельчают пленку и зерна из жидкой среды. Мазки из материала готовят бактериальной петлей, окрашивают по Граму и Цилю - Нельсену. Микроскопируют иммерсионным объективом .

Рис. 5. Актиномицеты: а- A. bovis; б- A. israelii; в — друзы

.В организме человека и животных, больных актиномикозом, образуются друзы (рис. 5, в) - мелкие, желтовато-белого цвета зерна. Друзу извлекают из гноя петлей и помещают в каплю воды на предметном стекле, слегка придавливают покровным, вводят под него каплю щелочного раствора метиленового синего и микроскопируют под малым увеличением микроскопа. В центре друзы обнаруживают густое сплетение бледно-голубых нитей с лучеобразно отходящими гифами, колбовидно утолщенными на концах. Элементы гноя в этом препарате окрашиваются в интенсивно синий цвет.

Спирохеты

Спирохеты - спирально извитые грамотрицательные активно подвижные бактерии. Они не имеют типичной для бактерии -клеточной стенки. Наружная и цитоплазматическая мембраны у большинства из них трехслойные. Цитоплазма у спирохет расположена в виде спирали

13

плотными завитками вокруг эластичной осевой нити (первичные завитки), а изгибы осевой нити представляют собой вторичные завитки.

Рис. 6. Морфология спирохет: а - трепонемы; б — боррелии; в — лептоспиры

Различаютсапрофитические спирохеты, обитающие во внешней среде, и

патогенные для человека, относящиеся к сем. Treponemataceae:

возбудитель сифилиса (Treponema, рис. 6, а), возвратного тифа (Borrelia, рис. 6, б), лептоспироза(Leptospira, рис. 6, в).

Для изучения морфологии спирохет применяют окраску по Романовскому - Гимзе, метод серебрения по Морозову и негативные препараты по Бурри. Изучают их также в живом состоянии с помощью фазово-контрастного устройства или в "темном поле" зрения. Эти методы

позволяют обнаружить специфическую форму и характер движенияспирохет.

Контрольныевопросы

1. Морфологические особенности актиномицетов и методы их окрашивания. 2. Что такое друза и как ее обнаружить? 3. Морфология и структура трепонем, леп-тоспир, боррелий, их тинкториальные свойства. 4. Какие болезни у человека вызывают актиномицеты, трепонемы, лептоспиры, боррелий?

Заданиядля самостоятельной работы

1.Изучение морфологии актиномицетов в окрашенных препаратах по Граму. Демонстрация друзы.

2.Изучение морфологии боррелий, трепонем и лептоспир в мазках, окрашенных по Романовскому — Гимзе. 3. Бактериоскопия лептоспир в "темном поле" зрения.

Риккетсииихламидии

Риккетсии. Это облигатные внутриклеточные бактерии, вызывающие у человека сыпной тиф и другие риккетсиозы. Они очень полиморфны, имеют кокковидную, палочковидную и нитевидную формы (рис. 7). Нередко встречаются в виде диплококков, напоминающих гантели. Обычные их размеры 0,2 - 0,3 х 0,3 - 1,0 мкм, некоторые виды способны проходить через бактериальные фильтры. Размножаются риккетсии в цитоплазме и ядре клеток тканей животных, человека, кровососущих(вши, клещи). Грамотрицательны.

Риккетсии хорошо окрашиваются по методу Здродовского. Тонкий препарат из органов трупа животного или культуры тканей высушивают на воздухе и фиксируют в пламени горелки, наливают разведенный феноловый фуксин Циля (10 - 15 капель на 10 мл дважды дистиллированной воды). Через 5 мин краситель смывают водой, и препарат на 1 - 3 с погружают вслабый раствор органической или минеральной кислоты (5 % лимонной или виннокаменной, 0,01 % соляной). После этого препарат хорошо промывают водой и окрашиваютоколо10 с0,5 % водным растворомметиленрвогосинего, снова промывают водой, высушиваюти микроскопируют.

Риккетсии окрашиваются в рубиново-красный цвет, клеточные элементы, в которых они находятся, - в голубой, ядра - в синий цвет.

рис. 7. Морфология риккетсии: а —кокки; б, в —палочки; г —нити

При окраске по Романовскому - Гимзе риккетсии приобретают сиреневый цвет.

Хламидии. Это тоже облигатнье паразиты, вызывающие трахому и бленнорею с включениями, орнитоз, паховый лимфогранулематоз. Они имеют кокковидную, овоидную или палочковидную форму. Размерыихколеблютсяот200 до500 - 800 нм. Окрашиваются по Романовскому-Гимзе.

При трахоме в цитоплазме эпителиальных клеток конъюнктивы глаза легко обнаруживают включения Провацека-Хальберштедтера.

Микоплазмы

Микоплазмы - мельчайшие (100 - 150 нм) микроорганизмы. Из-за отсутствия истинной клеточной стенки обладают выраженным полиморфизмом. В популяции микоплазм обнаруживают шаровидные, зернистые, нитевидные, гроздевидные и кольцевидные

14

микроструктуры. Необразуютспоринеимеютжгутиков.

Микоплазмы широко распространены в природе. Патогенные виды вызывают у крупного рогатого скота плевропневмонию, у человека - острые респираторные заболевания, атипичную пневмониюи другиемикоплазмозы.

Контрольные вопросы

1. Морфология и строение риккетсии. 2. Основные способы их окраски. 3. Какие заболевания вызывают хламидии? Способы их окраски. 4. Морфология и строение микоплазм. 5. Чем обусловлен полиморфизм микоплазм?

Задания для самостоятельной работы

1. Изучение препаратов риккетсий, окрашенных по Романовскому—Гимзе и Здродовскому. 2. Изучение строения микоплазм на электронограммах.

Вирусы

Общая характеристика. Вирусы - ультрамикроскопические организмы, не имеющие клеточного строения. Форма вирусов может быть сферической - вирус осповакцины (рис. 8, а), кубоидальной - вирус полиомиелита (рис. 8, б), палочковидной - вирус мозаичной болезни табака (рис. 8, в), сперматозоидной - фаги бактерий (рис. 9).

Рис. 8. Строение вирусов: а — осповакцины; б — полиомиелита; в — мозаичнойболезни табака.

Размерывирусовколеблютсявширокомдиапазоне: от 20 — 30 до 350 - 400 нм. Для определения размеров вирусов используют: 1) фильтрование через коллоидные фильтры с известной величиной пор; 2) быстроту осаждения при ультрацентрифугировании вирусов в буферных растворах; 3) диффузию и 4) фотографирование в электронноммикроскопе.

Крупные вирусы оспы и осповакцины были обнаружены Е. Пашеном под обычным световым микроскопом задолго до появления электронной

микроскопии (тельца Пашена). Для их выявления теперь используют специальные методы окраски мазков из пустул больного оспой, искусственно увеличивающие размер вируса. Из них наиболее эффективен метод серебрения по Морозову. При этом вирус оспы приобретает кокковиднуюформуичерныйцвет.

и промывают водой. Докрашивают 1 % водным раствором кислого фуксина в течение 1 мин и

15

снова промывают водой; обрабатывают смесью из равных частей насыщенного водного раствора пикриновой кислоты и 95 % спирта, быстро промывают, высушивают и погружают на несколько секундвабсолютныйспирт, вновьвысушиваютимикроскопируют.

Метод Муромцева. Кусочки гиппокампа растирают в ступке. Мазки делают на предметном стекле и фиксируют их метиловым спиртом или ацетоном в течение 1 - 2 ч, промывают водой, окрашивают 5-10 мин красителем Мансона (2 г метиленового синего, 5 г буры и 100 мл дистиллированной воды), разведенным 1:50. Мазки переносят в 10 % раствор танина до получения бледно-голубой окраски, промывают водой, высушивают, обрабатывают абсолютным спиртом несколькосекунд, высушиваютимикроскопируют.

При окраске срезов мозга по Туревичу тельца Бабеша-Негри (рис. 10,в) окрашиваются в вишнево-красный цвет с черными зернами внутри и легко обнаруживаются в светло-желтой цитоплазме нервных клеток. По Муромцеву, эти тельца окрашиваются в бледно-фиолетовый цвет, цитоплазма

клеток - в синий.

По Туревичу тельца Гуарниери(рис. 10,6) окрашиваются в тёмно-синий цвет и обнаруживаются в пораженных эпителиальных клетках.

Рис. 10. Тельца: а — Бабеша—Негри в нейронах гиппокампа; б — Гуарниери в эпителии

Контрольныевопросы

1. С помощью каких методов определяются размеры вирусов? 2. Способы обнаружения вирусов в световом микроскопе. 3. Внутриклеточные включения вирусов, их диагностическое значение и методы окраски.

Заданиядлясамостоятельнойработы

1.Изучение на электронограммах архитектуры основных групп вирусов. 2. Вирусоскопия телец Бабеша—Негри в гистологических срезах мозга, окрашенных по Туревичу и Муромцеву. 3. Окраска серебрением по Морозову препаратов оспенной вакцины.

Грибы

Грибы (Fungi) относятся к растительным гетеротрофным нефото-синтезирующим организмам, эукариотам, лишенным хлорофилла. В отличие от бактерий и других прокариотов они имеют дифференцированное ядро. Большинство грибов является многоклеточными, и только некоторые состоят из одной клетки. По форме клеток грибы подразделяются на гифомицеты и бластомицеты(дрожжи). Те и другие размножаются половым (совершенные грибы) и бесполым (несовершенные) путем.

Гифомицеты. В состав гифомицетов входят два класса - фикомицеты и аскомицеты. К классу Phycpmycetes, роду головчатой плесени принадлежит мукоровая плесень – Mucor mucedo. Мицелий этого широко распространенного в природе гриба состоит из одной сильно разветвленной клетки. Плодоносящие гифы-спорангиеносцы заканчиваются шарообразными спорангиями, наполненными эндоспорами (рис. 11, а). К классу Ascomycetes относятся сумчатые грибы, в частности леечная плесень - Aspergillus niger, которая имеет

Рис. 11. Морфология грибов: а - Мисог;

б — Aspergillus; в — Penicillium.

Конидиеносцы - одноклеточные плодоносящие гифы с булавовидными утолщениями на концах, покрыты вытянутыми образованиями - стеригмами, от которых четкообразно отделяются экзоспоры - конидии,

16

напоминающие струи воды, выливающиеся из лейки (рис. 11, б). В класс аскомицетов входит Penicillium, или кистевик, который содержит многоклеточный мицелий и многоклеточные конидиеносцы; они разветвляются в верхней части и заканчиваются стеригмами, расположенными в виде кисточек (рис. 11, в). От стеригм четкообразно отшнуровываются конидии. Некоторые пеницилловые плесени продуцируют пенициллин.

Морфологию гифомицетов изучают в "раздавленной" капле. Препаровальными иглами отделяют небольшой участок мицелия с плодоносящими гифами и прилегающим к ним тонким слоем питательной среды. Мицелий помещают на предметное стекло в каплю воды, иглой расправляют его, покрывают, слегка придавливая, покровным стеклом и микроскопируют. Сначала просматривают препарат объективом х 8 и только при обнаружении плодоносящих гиф устанавливаютобъективх40.

Бластомицеты(дрожжи). Этоодноклеточныегрибы, необразующие мицелия. Они принадлежат к классу аскомицетов, роду Saccharomyces, широко используются в пищевой промышленности. Дрожжевые клетки имеют округлую, овальную или вытянутую форму, размером 8-10 мкм (рис. 12, а). Оболочка у дрожжей двухконтурная, ядро отчетливо дифференцируется от цитоплазмы, в

которой имеются включения: гранулы волютина, гликоген и капли жира. Для обнаружения гликогена под покровное стекло вводят раствор Люголя, гликоген приобретает красно-бурый цвет.

Капли жира ок рашиваются Суданом III в ярко-красный цвет.

Рис. 12. Морфология дрожжей (а) и дрожжепо добных организмов (б)

Дрожжи размножаются почкованием, при неблагоприятных условиях - аскоспорами. Изучают дрожжи в живом состоянии, в "раздавленной" капле и в фиксированных мазках, окрашенных метиле-новым синим, в которых цитоплазма имеет голубой цвет, а гранулы волютина - синий.

К дрожжеподобным относятся грибы рода Candida (рис. 12, б). По морфологии грибы этого рода весьма сходны с истинными дрожжами, отличием служит отсутствие аскоспор и способность к образованию псевдомицелия, который представляет собой вытянутые в длину клетки, соприкасающиеся узким основанием. Морфологию их изучают в мазках, окрашенных по Граму. Грибы кандида вызывают кандидозы, которые развиваются у больных людей при резком ослаблении организма и длительном применении антибиотиков, угнетающих нормальную микрофлору человека.

Несовершенные грибы (Fungi imperfecti). Это грибы, которые утратили половой цикл развития и имеют многоклеточный мицелий. Из этого большого класса грибов особый интерес представляют возбудители дерматомикозов: фавуса, трихофитии, эпидермофитии, микроспории. Морфологию несовершенных грибов изучают в "раздавленной" капле после обработки раствором щелочи.

Контрольные вопросы

1. К какому типу организмов относятся грибы? Их классификация. 2. Строение фикомицетов.

3.Строение аскомицетов. Назовите полезные для человека виды — продуценты антибиотиков.

4.Строение истинных дрожжей. 5. Морфология и строение дрожжеподобных грибов рода кандида.

6.Что вы знаете о несовершенных грибах, почему они так называются?

Задания для самостоятельной работы

1. Приготовление препаратов "раздавленной" капли из культуры грибов мукор, аспергиллус и пенициллиум. 2. Изготовление мазков из дрожжей, окраска метиленовым синим. Микроскопия готовых препаратов дрожжеподобных грибов рода Candida. 3. Демонстрация дрожжей в 'раздавленной" капле методом фазово-контрастной микроскопии.

ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Методы стерилизации

Стерилизация (обеспложивание) - полное уничтожение всех микроорганизмов. Для стерилизации посуды, инструментов, питательных сред и других объектов применяют в основном физические и механические методы.

17

Физические методы стерилизации. Стерилизация в пламени проводится для обеззараживания бактериальных петель, игл, предметных и покровных стекол, пинцетов.

Стерилизация кипячением используется для обработки игл, шприцев, хирургических инструментов, которые кипятят в стерилизаторах в течение 30 - 45 мин. Для повышения точки кипения и устранения жесткости воды добавляют раствор 1 % соды. Однако этот метод не обеспечивает полного обеспложивания, так как споры бактерий и некоторые вирусы выдерживают кипячение в течение нескольких часов.

Стерилизация горячим воздухом проводится в электрических сухожаровочных шкафах различной формы и размеров, снабженных хорошей тепловой изоляцией. Необходимая температура автоматически поддерживается терморегулятором. В сухожаровых шкафах стерилизуют лабораторную посуду и шприцы при температуре 180°С в течение 1 ч. Чашки Петри, пастеровские и градуированные пипетки помещают в специальные металлические пеналы или заворачивают в бумагу по нескольку штук. Пробирки и колбы закрывают ватными пробками.

Стерилизацию паром осуществляют двумя способами - насыщенным паром под давлением и текучим паром.

Стерилизацию паром под давлением выполняют в автоклаве, который представляет собой толстостенный котел цилиндрической формы, покрытый снаружи кожухом и герметически закрывающийся крышкой. Автоклавы бывают горизонтальными и вертикальными. Пар поступает в рабочую камеру через патрубок из маленького котла, воду в который наливают через воронку, соединенную с указательной трубкой, и нагревают электротоком. Давление измеряют манометром.

Работа с автоклавом требует строгого выполнения правил, изложенных в специальной инструкции.

Не изменяющиеся под действием высокой температуры и давления питательные среды (мясо-пептонный агар, мясо-пептонный бульон), растворы или посуду с заразным материалом стерилизуют при 1 атм (121°С) 15-20 мин, среды с углеводами и нативными белками - при 0,5 атм (110°С) 5-10 мин. Материал и посуду, содержащие бациллы сибирской язвы, клостридии ботулизма, обеззараживают при 1 атм в течение 2 ч.

Контроль за соблюдением режимных параметров работы автоклава осуществляют с помощью максимального термометра и химических тестов - в автоклав помещают бензойную кислоту или бензонафтол с точками плавления 120°С и 110°С.

Стерилизация текучим паром проводится троекратно (дробно) в течение трех дней по 30 - 60 мин в автоклаве при незавинченной крышке и открытом выпускном кране или (лучше) в текучепаровом аппарате. Последний представляет собой металлический цилиндр, покрытый теплоизоляционным материалом с отверстием й конической крышке для выхода пара, краном и указательной трубкой в донной части. Внутри аппарата находится подставка для стерилизуемых материалов, в нее до половины высоты наливают воду. Воду подогревают любым источником тепла.

В текучепаровом аппарате стерилизуют питательные среды, изменяющие свои свойства при температуре выше 100°С: молоко, желатин, картофель и среды с углеводами. Вегетативные формы микроорганизмов при такой стерилизации погибают, а споры сохраняются. Спустя сутки при комнатной температуре некоторые споры прорастают, но повторное воздействие пара их уничтожает. Прогреванием в течение 3 суток полностью обезвреживают всю остальную спороносную микрофлору, которая к этому времени завершает вегетацию.

Свертывание (уплотнение) сыворотки и яичных сред производят в двухстенном свертывателе с электрическим нагревом. Аппарат покрыт теплоизоляционным материалом и имеет стеклянную и металлическую крышки. Воду в свертыватель наливают через отверстие, находящееся в верхней части и закрывающееся пробкой с вмонтированным термометром. Пробирки со средами укладывают на дно свертывателя в наклонном положении. Прогревают среды однократно или дробно при температуре 80 - 90°С в течение 1 ч.

Тиндализация - дробная стерилизация веществ, легко разрушающихся в текучепаровом аппарате и в свертывателе. Нагревание производят при температуре 56 - 58 °С в течение 1 ч 5-6 суток подряд в специальных приборах с терморегуляторами или на обычных водяных банях.

Пастеризация - частичная однократная стерилизация различных продуктов при 50-65 °С в

18

течение 1 ч или 70 - 80 °С в течение 5-10 мин. Используется для уничтожения в молоке неспороносных, преимущественно патогенных видов энтеробактерий и пиогенных кокков. При пастеризации пива, вина, плодовых соков инактивируются микроорганизмы, вызывающие их брожение. Пастеризованные продукты необходимо хранить на холоду.

Стерилизующими свойствами обладают ультрафиолетовые лучи с длиной волны 260 - 300 мкм, ионизирующая радиация и ультразвук. Это методы холодной стерилизации, они используются для обеспложивания воды, пищевых продуктов, питательных сред, вакцин, сывороток и других биологических препаратов.

Фильтрование как механический способ стерилизации. Методом фильтрации стерилизуют жидкие вещества, которые нежелательно подвергать действию высокой температуры, например сыворотки, антибиотики. Для этого из различных материалов изготовляют мелкопористые фильтры с точно градуированными порами, которые задерживают микроорганизмы и механически обеспложивают растворы.

В микробиологической практике широко применяют асбестовые фильтры, которые размещают на сетке опорной части воронки Зейтца с трубчатым наконечником и болтами скрепляют с полым цилиндромрезервуаром. Собранный фильтр Зейтца (рис. 13), обернутый бумагой, стерилизуют в автоклаве. Часто применяют мембранные фильтры из нитроклетчатки, их предварительно стерилизуют в течение 20 мин кипячением в дистиллированной воде.

Рис. 13. Фильтр Зейтца: а - воронка; б - асбестовый; в - нитроцеллюлозный фильтры; г — бунзеновская колба

Фильтрацию жидкости через фильтры Зейтца осуществляют вакуум-насосом, который присоединяется к отростку бунзеновской колбы. Фильтрование можно проводить также при положительном давлении. С этой целью цилиндр с фильтруемой жидкостью закрывают пробкой, в отверстие которой вставлена резиновая трубка, соединяющая фильтр с нагнетательным насосом

Питательные среды

Питательные среды должны содержать основные органогены, другие зольные элементы, микроэлементы, факторы роста, иметь соответствующий рН, быть изотоничными, обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом и вязкостью.

Питательные среды готовят из продуктов животного и растительного происхождения или из химически чистых соединений. По консистенции их делят на жидкие, полужидкие и плотные. К жидким питательным средам принадлежат мясо-пептонный, сахарный, кровяной и желчный бульоны, пептонная вода, молоко. Полужидкие среды содержат 0,15 - 0,5 % агара*. Плотными средами являются мясо-пептонный агар (2-3 % агара), мясо-пептонный желатин (10 - 15 % желатина**), свернутая сыворотка, свернутый яичный желток.

Питательные среды подразделяют на: 1) простые, или обычные; 2) специальные, к которым принадлежат элективные (избирательные), и 3) дифференциально-диагностические.

К простым, или обычным, средам относят мясо-пептонный бульон (МПБ) и мясопептонный агар (МПА). На этих средах культивируют большинство патогенных и сапрофитных бактерий: возбудителей чумы, бациллы сибирской язвы, энтеробактерии и др.

Специальные среды служат для выращивания микроорганизмов, не растущих на простых питательных средах. На кровяном, сывороточном и сахарном агаре и бульоне, например, культивируют стрептококки, на желточных средах - возбудитель туляремии.

Элективные, или избирательные, среды применяют для выращивания определенного

19

вида бактерий, в то время как размножение на них других видов бактерий задерживается. Так, на щелочной пептонной воде с рН 7,8 - 8,2 очень быстро развивается холерный вибрион; тифозно-паратифозные и дизентерийные бактерии растут на желчном бульоне и плотных средах с желчными солями; коринебактерии дифтерии лучше других растут на свернутой сыворотке.

Дифференциально-диагностические среды с углеводами, белками и индикаторами дают возможность выявить наличие или отсутствие определенных ферментов, что позволяет определить видовую принадлежность микроорганизмов.

Приготовление обычных питательных сред. Основой для приготовления этих сред служит мясная вода, содержащая экстрактивныее вещества.

Посуда. Питательные среды готовят в эмалированных кастрюлях. Разливают во флаконы, пробирки, чашки Петри.

Новую стеклянную посуду кипятят в 1 - 2 % растворе соляной кислоты для нейтрализации растворимой щелочи, затем тщательно промывают проточной водой и сушат. Бывшую в употреблении посуду стерилизуют, моют в мыльном или содовом растворе, хорошо прополаскивают и сушат. Сухие флаконы, колбы, пробирки закрывают ватными тампонами (пробками).

Мясная вода. 1. Свежую говядину или телятину, отделенную от костей, жира и сухожилий (500 г), пропускают через мясорубку, фapш заливают 1 л водопроводной воды, хорошо размешивают. Оставляют на сутки в прохладном месте или помещают на 2 ч в термостат при температуре 37 °С.

2.Настой отжимают через марлю, кипятят в течение 5 мин для свертывания белков, дают остыть. Фильтруют через ватный фильтр,доливают водой до первоначального объема и разливают в колбы и флаконы.

3.Стерилизуют 20 - 30 мин при 1 атм и сохраняют в темном месте. Мясная вода, не содержащая белка, имеет вид прозрачной желтоватой жидкости слабокислой реакции (рН 6,2 - 6,4), определенное количество аминокислот, витаминов группы В, солей, углеводов, факторов роста.

МПБ и МПА. Для приготовления МПБ к мясной воде прибавля-1 % сухого пептона (смесь альбумоз, полипептидов и аминокислот) и 0,5 % натрия хлорида. Устанавливают оптимальный рН среды (7,2-7,6), кипятят 30 мин, фильтруют, стерилизуют в автоклаве при 20 С 15-20 мин. МПА готовят, расплавляя в МПБ 0,5-3,0 % агара.

Сухие питательные среды. В настоящее время бактериологические лаборатории широко используют сухие питательные среды в виде порошков, хранящихся в герметично закрытых банках. Готовят эти среды по прописи, указанной на этикетке. Навеску порошка растворяют в определенном объеме дистиллированной воды, среду ризливают в соответствующую посуду и стерилизуют. Преимуществом сухих производственных сред является постоянство их состава, стандартность, удобство в приготовлении, легкость транспортировки.

Определение концентрации водородных ионов (рН) питательных сред производят электрометрическим методом с помощью рН-метров.

Приготовление специальных питательных сред. Сахарные МПБ и МПА. Чаще всего готовят бульон и питательный агар с 0,5 - 1,0 % раствором глюкозы. Стерилизуют их текучим паром 3 дня подряд по 30 мин или под давлением 0,5 атм в течение 10 - 15 мин. При наличии стерильных МПБ и МПА к ним прибавляют ампульные растворы глюкозы с последующим контролем на стерильность сред, выдерживаемых в термостате.

Агар и бульон с кровью или сывороткой. К стерильному расплав ленному охлажденному до 45 °С МПА и теплому МПБ прибавлявют 5 - 10 % дефибринированной крови, 20 - 25 % сыворотки крови. Тщательно перемешивают со средами; агар скашивают в пробирках разливают в чашки Петри.

Примечания: * Агар получают специальной обработкой морских водорослей. Он является веществом полисахаридной природы, содержит незначительное количество азота. Студень, образуемый агаром, расплавляется при температуре 70 — 100°С и застывает при комнатной температуре.

** Желатин представляет собой вещество белковой природы. Его готовят из костей, хрящей и отходов шкур телят. Точка плавления 10 % желатина 32 — 40°С.

20