Теоретичні відомості

Для культивування стерильних проростків необхідно використовувати ламінар-бокси, що забезпечують посадку експлантів на поживне середовище без зараження мікроорганізмами.

Усі поверхні ламінару обробляються 96 % спиртом, простерилізовані інструменти, матеріали, рослинний матеріал поміщають на стіл ламінару і вмикають УФ-випромінювання. Через 20 хвилин вимикають УФ і включають біофільтри. Для роботи в ламінар-боксі надівають стерильний халат і шапочку, руки обробляю 96 % спиртом. Пінцети, скальпелі і препарувальні голки поміщають в склянку з 96 % спиртом. Перед кожною маніпуляцією інструменти обпалюють на полум'ї спиртівки.

Матеріали і устаткування. Ламінар-бокс, пробірки з поживними середовищами, стерильні препарувальні голки, пінцети, скальпелі, флакон з 96 % спиртом, спиртівка, вата, 6 % розчин хлораміну, колби з автоклавованою дистильованою водою, чашки Петрі, зернівки пшениці.

Хід роботи.

1. Відібрати 10 здорових зернівок пшениці, помістити в 6 % розчин хлораміну на 5 хвилин, промити стерильною дистильованою водою.

2. Зернівку помістити на стіл ламінару борозенкою вниз.

3. Однією препарувальною голкою притримувати зернівку, іншою - надрізати оболонку навколо зародка.

4. Бічною частиною голки натиснути на зародок (на межі з ендоспермом) і вичленувати його із зернівки.

5. Зародок помістити в чашку Петрі із стерильною дистильованою водою.

6. Узяти зі штативу пробірку з поживним середовищем, обпалити шийку над спиртівкою, зняти пробку. Пробірку тримати відкритою частиною від себе.

7. Препарувальною голкою перенести зародок на поверхню поживного середовища щитком вниз (не заглиблювати).

8. Пробірку і шийку пробірки обпалити на полум'ї спиртівки, пробірку закрити.

9. Пробірки із зародками поставити в штатив і перенести на стелаж в культуральну кімнату.

10. Проростки пшениці замалювати через 1-2 тижні. Оцінити якість посадки.

Контрольні питання до теми 1.

1. Як влаштована біотехнологічна лабораторія?

2. Як простерилізувати поживні середовища, посуд, дистильовану воду, інструменти, приміщення лабораторії?

3. Які стерилізуючі розчини використовуються для рослинних експлантів?

4. Які речовини входять до складу поживних середовищ, і яку функцію вони виконують в культурі клітин і тканин in vitro?

5. Як отримують стерильні проростки і для чого їх використовують?

Тема 2. Мікроклональне розмноження рослин і отримання безвирусного посадочного матеріалу.

Робота 1. ВИЧЛЕНЕННЯ АПІКАЛЬНИХ МЕРИСТЕМ І

Регенерація рослин Теоретичні відомості

У культурі тканин можна розмножувати рослини і отримувати оздоровлений (безвірусний) посадковий матеріал. Для оздоровлення рослин використовують культуру апексів або культуру апікальних меристем, оскільки в стебловий апекс віруси проникають повільніше, ніж в інші частини рослин. При культивуванні апексів розмноження вірусів пригнічується реакцією рослинного організму на травму, викликану відсіканням верхівки. Зазвичай на поживні середовища висаджують невелику частину меристеми до 0,5 мм.

В цілому закономірність така: чим менше величина меристеми, тим більше вірогідність отримання безвірусних рослин.

Біотехнологія дозволяє отримувати безвірусний посадковий матеріал практично усіх сільськогосподарських культур. Найбільш повно розроблена технологія отримання безвірусного матеріалу картоплі. Система первинного насінництва і оздоровлення посадкового матеріалу картоплі включає наступні етапи: підготовка бульб для вичленення апікальних меристем, вичленення апікальних меристем, регенерація рослин з меристем, адаптація рослин-регенерантів в захищеному грунті, отримання первинної продукції безвірусного матеріалу у відкритому грунті, вирощування безвірусного посадкового матеріалу в первинних ланках насінництва, збереження колекції сортів.

У культурі тканин використовуються апекси верхівкових і бічних бруньок. Щоб виключити вплив метаболитів бульби на проростки і підвищити регенерацційну здатність початкового матеріалу з середньої частини бульби вирізають очка з частиною паренхіми (1,5 г 1,5 см). Очка пророщують на піску, заздалегідь обробленому сухим жаром. Етіольовані проростки вирощують в темряві при температурі 25 + 2^оС, вологості повітря 70-80 %. Пісок двічі в день зволожують, через 7-10 днів проводять підгодівлю розчином Кнопа.

Апікальні меристеми проростків ізолюють на 12-13 пластохроні ( пластохрон - проміжок часу між ініціаціями двох листових горбків. В середньому від посадки меристеми на середовище до формування проростків з 5-6 листочками проходить 30-45 днів, в деяких випадках від 2 до 8 місяців. Середовища по мірі виснаження оновлюють, і проростки періодично пересаджують на нові середовища в стерильних умовах).

Ізольовані меристеми культивують в асептичних умовах на поживних середовищах з багатим вмістом макро- і мікросолей, з підвищеною концентрацією цитокінінів (6-БАП 2 мг/л). У культуральній кімнаті з кондиціонованим повітрям підтримують температуру 25 + 2^оС, вологість повітря 70 %, освітленість 5 кLx і фотоперіод 16 годин.

Матеріали і устаткування. Ламінар-бокс, бінокулярний мікроскоп МБС- 9 або МБС- 10, флакони із стерилізуючими розчинами, (0,2 % діацид або 70 % спирт), чашки Петрі, стерильна дистильована вода, стерильні інструменти: пінцети, препарувальні голки, скальпелі, спиртівка, пробірки з середовищем.