Теоретичні відомості

З метою отримання експлантів для калусної і пухлинної культур, мікроклонального розмноження, вивчення гормональної регуляції використовують стерильні проростки. Насіння для пророщування висівають або на воду, або на поживне середовище.

Рослинні об'єкти перед стерилізацією ретельно відмивають проточною водою, іноді з миючими засобами, очищають від зайвих тканин. З коренеплодів і коріння знімають шкірку, з пагонів - кору, з бруньок – покривні луски.

Рослинні експланти стерилізують розчинами речовин, що містять активний хлор (хлораміном, гіпохлоритом Са і Nа, сулемою), бром (бромистою водою), перекисом водню, спиртом, нітратом срібла, діацидом, антибіотиками. Етиловий спирт часто застосовують для попередньої стерилізації, протираючи ним поверхню матеріалу або занурюючи матеріал на декілька секунд в абсолютний спирт. Іноді такої стерилізації вистачає, її використовують при роботі з плодами, насінням, пагонами, зав'язями.

Гіпохлорит кальцію (хлорне вапно) використовується у вигляді 5-7 % розчину для обробки бруньок, зав'язей, квіток, насіння, пагонів протягом 5-8 хвилин. Гіпохлорит натрію використовується у вигляді 0,5-5 % розчину для обробки будь-яких експлантів протягом 1-20 хвилин. Ця речовина є клітинною отрутою, тому час стерилізації і концентрацію підбирають експериментально. Наприклад: для ізольованих зародків використовують 2-3 % розчин протягом 10-15 хвилин, а для сухого насіння 3-5 % розчин протягом 1 години. Залишки гіпохлориту натрію спочатку видаляють 0,01 н HCl, а потім 8 разів промивають автоклавувальною дистильованою водою.

Хлорамін застосовують в концентрації 1-6 %. Пильники і молоді зародки обробляють протягом 1-3 хвилин, сухе насіння - 30-60 хвилин, потім промивають стерильною дистильованою водою 2-3 рази.

Сулема - токсична речовина і вимагає особливої ретельності, як при зберіганні, так і при виборі концентрації для окремих об'єктів. Для стерилізації зародків використовують 0,1 % розчин протягом 1-3 хвилин, для корене- і бульбоплодів - до 10-20 хвилин.

Розчини, що містять активний хлор використовуються 1 раз і готують їх безпосередньо перед роботою.

Діацид використовується в 0,2 % розчині для стерилізації коренеплодів, насіння, шматочків тканин, верхівкових меристем, ізольованих зародків, пильників. Діацид готують, розчиняючи окремо 330 міліграм етанолмеркурхлориду і 660 міліграм цетилпіридинію хлориду в гарячій воді (330 мл), потім їх змішують і доводять об'єм рідини до 1 л, додають декілька крапель детергента твін- 80; зберігають в щільно закритій колбі в темряві.

Антибіотики застосовують для стерилізації рослинного матеріалу, інфікованого бактеріями (тканини корончатогалових пухлин). Найчастіше застосовують стрептоміцин і тетраміцин 10-80 мг/л, ампіцилін 200-400 мг/л, левоміцитин, каноміцин і інші.

Матеріали і устаткування. Стерильні чашки Петрі, колби з автоклавованою дистильованою водою, флакони із стерилізуючими розчинами, зернівки пшениці і тритікале, ламінар-бокс, флакон з 96 % спиртом, вата, спиртівка, пінцети, фільтрувальний папір.

Хід роботи.

1. Відібрати 30 здорових зернівок пшениці або тритікале.

2. У ламінар-бокс помістити насіння в чашки Петрі із стерилізуючими розчинами по 5 насінин в кожну (6 % хлорамін, 6 % гіпохлорит кальцію, 96 % спирт, сулема 0,1 %, ампіцилін 400 мг/л, вода). Час стерилізації підібрати експериментально.

3. Відмити насіння від стерилізуючих розчинів дистильованою автокла-вованою водою.

4. Помістити насіння для пророщування в стерильні чашки Петрі на стерильний фільтрувальний папір в невелику кількість стерильної дистильованої води. Чашки Петрі закрити і перенести в термостат для пророщування.

5. Результати досліду замалювати через тиждень. Зробити висновки про ефективність стерилізуючих розчинів.

Робота 5. ТЕХНІКА РОБОТИ В ЛАМІНАРІ ПРИ КУЛЬТИВУВАННІ СТЕРИЛЬНИХ ПРОРОСТКІВ.