Хід роботи.

1. У хімічну склянку місткістю 2 л помістити 20 г сахарози, долити дистильованої води до 400 мл і розчинити.

2. Додати до розчину сахарози 50 мл маточного розчину макросолей, 1 мл мікросолей, 5 мл хелату заліза, 5 мл хлористого кальцію.

3. Приготувати агар: наважку 7 г помістити в склянку і залити водою до 200 мл, розчинити, нагріваючи на плитці або газовому пальнику, при постійному перемішуванні. Готовий агар долити до розчину солей.

4. Поживне середовище довести до потрібного об'єму (1 л) дистильованою водою. Виміряти pH середовища: якщо pH перевищує 5,5-6,0 додати декілька крапель 0,1 н HCl, якщо нижче за це значення - 0,1 н КОН.

5. Готове поживне середовище розлити в пробірки на 1/3 об'єму, закрити пробірки ватними корками, помістити пробірки в металеві штативи.

6. Штативи з пробірками загорнути в целофановий папір (щоб в автоклаві не відкрилися корки).

7. Помістити штативи з пробірками в автоклав і проавтоклавувати.

Робота 3. МЕТОДИ СТЕРИЛІЗАЦІЇ

Теоретичні відомості

Усі роботи з культурою клітин і тканин in vitro проводять в стерильних (асептичних) умовах в стерильному боксі або ламінар-боксі, стерильними інструментами, в стерильному посуді, на стерильних поживних середовищах. У разі порушення стерильності на середовищах добре розвиваються мікроорганізми (гриби, бактерії), створюються умови, при яких порушується склад і пригнічують ріст рослинних експлантів.

Найчастіше для стерилізації приміщень (боксів для пересадки тканин, культуральних кімнат) використовують ультрафіолетове опромінення протягом 0,5-2 годин (залежно від площі приміщення). Роботи в опроміненому приміщенні починають через 15-20 хвилин після відключення бактерицидних ламп, оскільки під дією ультрафіолетового випромінювання двоатомний кисень повітря стає трьохатомним озоном - газом, токсичним для людини. Для досягнення максимальної стерильності перед обробкою УФ усі поверхні ретельно миються миючими засобами, водою і розчинами хлоровмісних речовин, поверхні ламінар-боксу обробляють 96 % спиртом.

Посуд, халати, вату, папір, дистильовану воду, поживні середовища стерилізують в автоклавах під тиском пари 1-2 атм і температурою 120^оС протягом 20-60 хв, залежно від об'єму матеріалу, що стерилізується.

Колби, штативи з середовищем, вату, папір, халати перед автоклавуванням завертають в целофановий папір, або поміщають в бюкси.

Металеві інструменти автоклавувати не можна, оскільки під дією пари утворюється іржа. Тому їх стерилізують сухим жаром в термостатах з температурою 170-250^оС протягом 1-2 годин.

Матеріали і устаткування. Чашки Петрі, колби з дистильованою водою, штативи з пробірками, заповненими поживним середовищем, препарувальні голки, пінцети, скальпелі, вата, марля, папір: фільтрувальний і целофановий.

Хід роботи.

1. Металеві інструменти загорнути в щільний папір і помістити в сушильну шафу для стерилізації сухим жаром при t=170-200^oС протягом 2 годин.

2. Чашки Петрі, штативи з пробірками, заповненими поживним середовищем, вату, марлю, фільтрувальний папір, колби з дистильованою водою (закриті фольгою) загорнути в целофановий папір і помістити в автоклав.

3. Автоклав привести в робочий стан: закрити щільно кришку, воду залити до мітки. Включити автоклав, тиск пари довести до мітки 1,2 атм. (у паровій камері) заповнити парою камеру стерилізації, витіснити конденсат протягом 10 хв., при цьому тиск пари в камері стерилізації має бути на рівні 0,1-0,2 атм. Довести тиск в камері стерилізації до 1 атм., включити автоматичний режим.

4. Автоклавувати 20 хв. при тиску в камері стерилізації 1-1,2 атм.

5. Відключити автоклав, витіснити пару з обох камер, довести тиск до 0 атм.

6. Проавтоклавувальні матеріали перенести в кімнату для пересадки тканин і помістити в шафи або на стелажі.

Робота 4. СПОСОБИ СТЕРИЛІЗАЦІЇ РОСЛИННИХ ЕКСПЛАНТІВ