І яблуні.

Теоретичні відомості

Гаплоїдія є таким зменшенням числа хромосом, при якому в половинному наборі соматичної і статевої клітин кожна пара гомологічних хромосом представлена лише по одній з них. Гаплоїдом або моноплоїдом називають організм, що має в соматичних клітинах гаплоїдний набір негомологічних хромосом. Генотип гаплоїдів має характерні особливості. У гаплоїдів проявляються рецесивні гени. Гаплоїди на вигляд схожі з відповідними диплоїдами, але менше їх. Клітини гаплоїдів мають менший розмір, ніж клітини диплоїдів. Гаплоїди не утворюють повноцінних гамет. Шляхом подвоєння числа хромосом соматичних клітин гаплоїду можна отримати повністю гомозиготну диплоїдну рослину.

Гаплоїди отримують, використовуючи гаплопродюсерів (віддалену гібридизацію), партеногенез. Гаплоїди можна отримати в культурі тканин з пильників і клітин зародкового мішка, гаплоїди в культурі тканин вже отримані у 200 видів рослин.

Для більшості рослин оптимальним терміном посадки пильників на поживні середовища є стадія "середніх" або "пізніх" одноядерних вакуолізованих мікроспор. На цій стадії мікроспори вивільняються з тетрад і готуються до першого мітозу.

Для культивування пильників використовують середовища: Мурасіге-Скуга з 1/2 концентрацією солей, китайські середовища, середовища з картопляним екстрактом, середовище Ніч. Ауксини або взагалі не додають, або використовують 2,4-Д. З цитокінінів застосовують кінетин і 6-БАП. Агар-агар ретельно промивають, оскільки він містить речовини, що несприятливо впливають на розвиток пильників. Для адсорбції метаболітів, що інгібірують процеси росту в культурі тканин в поживні середовища додають активоване вугілля.

Перед культивуванням пильники витримують при температурі 4-6^о С протягом 2-8 діб. Ізольовані пильники культивують або в темряві, або при слабкому освітленні при температурі 25 + 2^о С.

На поживних середовищах мікроспора може утворити калус або гаплоїдний зародок (спочатку утворюється 40-50-клітинний проембріон). Зародок в глобулярній стадії розриває екзину і проходить стадії, аналогічні розвитку зиготного зародка. Пилок ділиться, клітини збільшуються, екзина розривається і утворюється калус, на якому, змінюючи співвідношення фітогормонів, можна отримати гаплоїдні ембріоїди. Отримання гаплоїдів біотехнологічними методами дозволяє швидко створювати гомозиготні лінії, що робить цю технологію дуже цінною для селекції і генетики.

В процесі культивування ізольованих пильників на поживних середовищах розвиток йде двома шляхами: або прямим андрогенезом (утворенням ембріоїдів і гаплоїдних рослин-регенерантів), або непрямим андрогенезом, коли репродуктивні клітини дедиференціюються і переходять до проліферації, утворюючи спочатку калус, а потім при пасивуванні на спеціальні середовища - морфогенный калус і регенеранти.

Матеріали і устаткування. Ламінар-бокс, бутони вишні і яблуні, пробірки з середовищем для калусогенезу, препарувальні голки, пінцети, флакон з 96 % спиртом, 6 % розчин хлораміну, вата, фольга.

Хід роботи.

1. Бутони стерилізують в 6 % розчині хлораміну 10 хвилин, для цього поміщають бутони в марлевий мішечок по 20 штук в кожний і опускають в склянку із стерилізуючим розчином, потім ретельно промивають бутони (5-6 разів) стерильною дистильованою водою.

2. Переносять бутони на стерильну поверхню столу ламінар-бокса, обережно відокремлюють пилкові мішки від тичинкових ниток.

3. Стерильною препарувальною голкою переносять пильники на поверхню поживного середовища в пробірки по 5-10 пильників в кожну.

4. Закривають пробірки і переносять в термостат з температурою 26^оС і вологістю 70 %.

5. Результати роботи замальовують через 2-4 тижні.

Робота 2. ОТРИМАННЯ РОСЛИН-РЕГЕНЕРАНТІВ З ПИЛКОВИХ КАЛУСІВ ВИШНІ.