Теоретичні відомості

Культивування окремих (поодиноких) клітин дозволяє отримувати клони і досліджувати генетичну та фізіологічну стабільність або мінливість клонового матеріалу. Поодинокі клітини або ізольовані протопласти використовуються в клоновій селекції, гібридних і трансформованих ліній мутантів. У ці клітини можна ввести нові гени, в той же час - це хороша модель для вивчення онтогенезу і фізіології клітини.

Джерелом окремих (поодиноких) клітин є клітинні суспензії, які ростуть на рідкому поживному середовищі; мацеровані тканини рослин (мезофіл листа); ізольовані протопласти після відновлення клітинної стінки.

Найбільш ефективними методами для отримання поодиноких клітин є: метод "годуючого шару" або "культури-няньки", кондиціонованих середовищ, мікрокрапель. Для отримання генетично стабільних клонів і клітинної селекції використовується метод Плейтинга.

Матеріали і устаткування. Колби з суспензією, стерильні чашки Петрі, стерильний циліндр, чашки Петрі з агаризованим середовищем, інструменти: пінцети, препарувальні голки, спиртівка, 96 % спирт.

Хід роботи.

1. Піпеткою відібрати 5 мл верхньої фракції суспензії (у верхньому шарі суспензії переважає фракція поодиноких клітин) і змішати з 5мл агаризованого (1,4 % агару) середовища для культивування калусу. Роботу проводити в стерильному посуді: мірному циліндрі, склянці.

2. Отриману суміш розлити в стерильні чашки Петрі шаром до 1 см.

3. Чашки Петрі закрити кришками і герметизувати парафіном.

4. Кількість колоній підрахувати через 4-6 тижнів.

5. Результати замалювати, підрахувати густину висіву за формулою:

кількість колоній, які утворились

Ефективність висіву =  100 %

кількість висіяних клітин

Контрольні питання до теми IV.

1. Що таке суспензійні культури і які основні способи їх одержання?

2. Як визначити міру агрегації і життєздатності суспензій?

3. Як підрахувати густину суспензії?

4. Які основні способи культивування одноклітинних суспензій?

5. У яких галузях виробництва і науки використовують суспензійні культури?

Тема V. Гормональна регуляція в культурі клітин

І ТКАНИН.

Робота 1. ІНДУКЦІЯ ОРГАНОГЕНЕЗУ І СОМАТИЧНОГО

ЕМБРІОГЕНЕЗУ В КАЛУСНІЙ ТКАНИНІ ТЮТЮНУ

ПІД ДІЄЮ ФІТОГОРМОНІВ

Теоретичні відомості

Фітогормони - це біологічні регулятори росту і розвитку рослин, що здійснюють взаємодію клітин, тканин та органів, які стимулюють морфогенетичні, і інгібують фізіологічні процеси в рослинних організмах. Фітогормони впливають на ділення і ріст клітин розтягуванням, стан спокою, дозрівання, старіння, формування статі, стійкості до стресу, тропізми, транспірування; забезпечують функциональну цілісність рослинного організму, закономірну послідовність фаз індивідуального розвитку.

За хімічною природою гормони рослин чітко підрозділяються на дві групи: похідні мевалонової кислоти (гіберелліни, абсцизини, брасини, фузикокцин, цитокініни), похідні амінокислот (ауксини - з триптофану, етилен - з метіоніну і аланіну). Біосинтез фітогормонів відбувається в певних частинах рослин: в апексах пагонів утворюється ІОК- індоліл-3-оцтова кислота, лист служить донором ключового продукту синтезу гіберелінів - каурену, а також абсцизової кислоти, в апексах коріння синтезується кінетин, а в зоні розтягування кореню - гібереліни, джерелом зеатину є ендосперм проростаючого насіння.

По функціональній дії розрізняють 5 основних груп фітогормонів: ауксини, цитокініни, гіберелліни, абсцизини і етилен. Ауксини в культурі тканин викликають ріст клітин розтягуванням, у великих концентраціях - ділення клітин, у поєднанні з цитокінінами - органогенез. У біотехнології застосовують як природні ауксини (ІОК), так і синтетичні [ІМК (індоліл-3-масляна кислота), ІПК (індоліл-3-пропіонова кислота), 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота), НОК (нафтилоцтова кислота)].

Цитокініни у поєднанні з ауксинами індукують мітози, проліферацію клітин, бруньок і пагонів. До природних цитокінінів відносяться: зеатин, кінетин (6-фурфуриламінопурин), NN -дифенілсечовина (кокосове молоко); до синтетичних - 6-БАП (6-бензиламінопурин).

Гіберелліни стимулюють ріст клітин розтягуванням, а також синтез ауксинів і цитокінінів. Зараз відомі близько 60 видів гібереллінів. У культурі тканинин використовується гіберелінова кислота.

Абсцизини (АБК - абсцизова кислота) і етилен інгібірують ростові процеси, ділення клітин, у поєднанні з цитокінінами і хлорхолінхлоридом індукують органогенез (утворення мікробульб).

Гормональна система тісно пов'язана з генетичним апаратом клітини. Фітогормони не лише впливають на міру метилування ДНК і таким чином регулюють експресію генів, але і зв'язуються з білками - репресорами на опероні, що призводить до активації структурних генів і синтезу певних ферментів. Отже, змінюючи співвідношення гормонів в поживних середовищах, можна якоюсь мірою змінювати і генетичні програми клітин та тканин. Ці процеси відомі як дедиференціація, редиференціація і диференціація клітин і тканин.

Матеріали і устаткування. Пробірки з калусами тютюну, колби на 50 мл із стерильним поживним середовищем (МС без гормонів), колби з середовищами для стеблового органогенезу і соматичного ембріогенезу і індукції ризогенезу, флакони з 96 % спиртом, стерильні пінцети і препарувальні голки, спиртівка, ламинар-бокс.