Хід роботи.

1. Насіння квасолі помістити в чашки Петрі (по 15 штук в чашку), залити розчином хлораміну до повного занурення насіння в рідину і залишити на 20 хвилин.

2. Промити насіння стерильною дистильованою водою 3 рази.

3.Стерильне насіння залити стерильною водою і залишити для набрякання на 24 години.

4. Насіння із зруйнованою шкіркою видалити, а життєздатне насіння простерилізувати повторно 6% хлораміном 20 хвилин.

5. Промити насіння стерильною дистильованою водою 3 рази.

6. Насіння перенести в стерильні чашки Петрі (по 5 штук в чашку).

7. Стерильним пінцетом притримувати насіння, а стерильним скальпелем надрізати оболонку.

8. Стерильним скальпелем і препарувальною голкою ізолювати корінці (2-3 мм) і перенести в чашки Петрі із стерильною дистильованою водою (по 15 штук в чашку).

9. Корінці стерильною препарувальною голкою помістити на поверхню агаризованого середовища і злегка втиснути в агар для забезпечення хорошого контакту з середовищем (середовище ШХ+10 мг/л п-ХФУК+2 мг/л 2,4Д+0,1 мг/л кінетина).

Робота 4. СУБКУЛЬТИВУВАННЯ КАЛУСІВ.

Теоретичні відомості

У циклі вирощування калусні клітини після ряду ділень проходять звичайний онтогенез: ростуть розтягуванням, диференціюються і деградуюють. Ріст калусу зовні відображає S-подібна крива. Ростовий цикл починається з посадки експланту на середовище (початок культивування), а завершується у момент припинення мітозів (стаціонарна фаза).

У лагфазі (латентній фазі) клітини не діляться, не збільшуються в розмірі, мають низьку метаболічну активність. У експоненціальній фазі (фазі логарифмічного росту) клітини активно діляться мітозом. У ранній експоненті збільшується кількість мітохондрій (синтезується АТФ), рибосом, усіх видів РНК, синтезуються білки, активізується метаболізм, інтенсивно поглинається кисень. Пізня експонента або фаза латентного росту, характеризується зниженням питомої швидкості росту, уповільненням клітинного ділення, збільшенням середнього розміру клітин за рахунок розтягування. У стаціонарній фазі розмір клітин продовжує збільшуватися, а їх ділення припиняється. У пізній стаціонарній фазі (фаза деградації) за рахунок виснаження середовища клітини старіють і помирають.

Тривалість ростового циклу калусних клітин 21-28 днів. У процесі культивування калус страхують (пересаджують на свіже поживне середовище) кожні 4-6 тижнів. Маса транспланту (фрагменту тканини, який страхують на свіже поживне середовище) складає 60-100 мг на 20-40 мл середовища.

Матеріали і устаткування. Пробірки з калусами, пробірки з поживним середовищем для культивування калусів, інструменти: пінцети, препарувальні голки, флакон з 96 % спиртом, ламінар-бокс, спиртівка.

Хід роботи.

1. У асептичних умовах витягнути каллуси з пробірок і помістити на стерильну поверхню (столик ламінар-боксу, оброблений 96% спиртом і УФ-опроміненням), стерильною препарувальною голкою виділити зони меристематичної активності (білі дрібні клітини).

2. Транспланти розміром 2-3 мм помістити на поверхню поживного середовища (МС+ІОК - 0,5 мг/л + кінетин - 0,5 мг/л).

3. Результати культивування замалювати через 2-4 тижні, за результатами зважувань через 1-2-3-4 тижні побудувати графік росту калусу.

Контрольні питання до теми Ш.

1. Назвати основні способи культивування калусів.

2. Що таке дедиференціація і проліферація клітин?

3. Чим характеризуються основні фази ростового циклу калусу?

4. Чи відрізняються за морфологією калуси різних видів рослини?

5. Для яких цілей використовують культуру калусів в біотехнології, генетиці і селекції?

6. Які поживні середовища використовують для індукції калусогенезу і культивування калусів?