Хід роботи.

1. Розчин РНК-ази профільтрувати через фільтр Зейтца, додати в 100 мл середовища Мурасиге-Скуга і розлити в пробірки із застиглим стерильним середовищем до 0,5 см

2. Простерилізувати проростки картоплі в 6 % хлораміні 5 хвилин.

3. Проростки промити стерильною дистильованою водою і помістити в стерильні чашки Петрі.

4. В умовах ламінар-боксу під мікроскопом вичленувати апікальні меристеми і помістити на середовища без ферменту (контроль) та з ферментом (досвід).

5. Пробірки з меристемами перенести в культуральну кімнату.

6. Результати замалювати через 2-4-6 тижнів, зробити висновки.

Контрольні питання до теми 2.

1. Що таке мікроклональне розмноження рослин : основні етапи?

2. Які основні способи мікроклонального розмноження?

3. Як отримати безвірусний посадковий матеріал?

4. Який із способів отримання безвірусного посадкового матеріалу ви б вважали кращим у своїй роботі?

5. Чим відрізняються поживні середовища для проліферації пагонів, індукції корнеутворення, культивування меристем, отримання мікробульб?

6. Як протестувати посадковий матеріал на міру зараження вірусами?

ТЕМА Ш. ДЕДИФЕРЕНЦІАЦІЯ І КАЛЛУСОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРІ РОСЛИННИХ КЛІТИН І ТКАНИН.

Робота 1. ОТРИМАННЯ КАЛЛУСІВ З ЛИСТЯ ТЮТЮНУ.

Теоретичні відомості

Калусна клітина, в результаті ділення якої виникає калус, є одним з типів клітинного диференціювання. Для рослини in vivo каллус - це група клітин, що виникає при травмах і захищає місце поранення (ранева паренхіма). У ній накопичуються поживні речовини для регенерації анатомічних структур або втраченого органу.

Диференційовані клітини об'єднуються у рослині в тканини і виконують певні функції. Клітини розрізняються не лише функціонально, але і морфологічно.

На поживних середовищах з великим вмістом ауксинів (2,4 Д) клітини експланту дедиференціюються і переходять до проліферації. Особливості дедиференціації клітин експланту залежать від генетики і епігенетики експланту. Клітини втрачають колишні функції і морфологію. Причому, чим менше структурно і хімічно диференційована клітина, тим легше отримати калус.

У клітині, підготовленій до ділення, стимулюється синтез усіх форм РНК, починається реплікація ДНК, зникають специфічні тканинні білки-антигени, синтезуються нові, специфічні для каллусних клітин. Міняється активність структурних генів і білкового апарату клітин. Дедиференціація спеціалізованих клітин починається із збагачення їх елементами цитоплазми: мікротрубочками, мембранами ЕПС і комплексу Гольджі, рибосомами, зникають хлоро- і хромопласти, продукти їх діяльності; може утворюватися багато ядер або збільшуватися число хромосом; збільшуватися вакуолі.

Калус, що вирощується поверхневим способом, є аморфною масою тонкостінних паренхімних клітин, що не має строго визначеної структури. Клітини калусу або безбарвні, або мають жовтуватий відтінок. Залежно від походження і умов культивування розрізняють калуси: рихлі, з сильно оводненими клітинами, що легко відділяються один від одного; середньої густини, із зонами меристематичної активності; щільні, із зонами зредукованого камбію і судин.

У біотехнології, для відпрацювання методик культивування, частіше усього використовують ті види рослин, які і в звичайних умовах легко вкорінюються, регенерують, утворюють калус. Тому більшість методів отримання і культивування калусу розроблена для тютюну. Калуси можна отримати практично з будь-якої частини рослини, оскільки клітини тютюну легко дедиференціюються і переходять до проліферації. Для культивування калусів з листя тютюну використовують середовище Мурасіге-Скуга з додаванням ауксинів (2,4 Д).

Матеріали і устаткування. Рослини тютюну, 6% розчин хлораміну, колби із стерильною дистильованою водою, чашки Петрі із стерильним поживним середовищем для індукцій калусогенезу.