obobwmju

ЛЕКЦІЯ IV

ГЕНЕТИКА МІКРООРГАНІЗМІВ

1.Розвиток вчення про генетику мікроорганізмів

2.Класифікація форм мінливості мікроорганізмів

3.Основні поняття генетики мікроорганізмів

4.Організація генетичного матеріалу бактерій

5.Мутаційна й адаптивна форми мінливості

6.Комбінативна форма мінливості мікроорганізмів

7.Практичне значення генетики мікроорганізмів

ігенна інженерія в медичній мікробіології

Генетика мікроорганізмів — наука про закони спадковості і мінливості мікроорганізмів, тобто про те, як успадковуються оз- наки у мікроорганізмів і відбувається їхня зміна.

1. РОЗВИТОК ВЧЕННЯ ПРО ГЕНЕТИКУ МІКРООРГАНІЗМІВ

Генетика мікроорганізмів пройшла у своєму розвитку 3 етапи. Перший етап (друга половина XIX ст.) характеризується ста- новленням наукової мікробіології, описанням видів мікроор- ганізмів, одержанням перших даних про мінливість мікробів. У цей період відбувалася боротьба між двома полярними напрям- ками — мономорфізмом (Кох, Кон), який визнавав незмінність видів бактерій, і плеоморфізмом (Негелі), який вважав мінливість мікробів до такої міри безмежною, що йшлося про один пато- генний мікроорганізм Coccobacteria septica, здатний, залежно від умов, спричинювати найрізноманітніші інфекційні захворю-

вання. На цьому етапі перемогу здобули мономорфісти.

На другому етапі (перша половина XX ст.) відбувалося по- ступове накопичення відомостей про мінливість мікроорганізмів, вплив різних факторів на процеси мінливості. Важливий внесок зроблено роботами Г. А. Надсона і Г. С. Філіппова (1925), які вивчали мутагенну дію рентгенівських променів на дріжджі. Од-

79

нак вважалося, що закони спадковості і мінливості вищих організмів не можна застосувати до бактерій.

Третій (сучасний) етап розвитку генетики мікроорганізмів роз- починається з 1944 р., коли була опублікована робота О. Ейвері, К. Мак-Лауда і К. Мак-Карті, де вперше було експериментально доведено генетичну роль ДНК. Ця робота, основоположна для молекулярної біології і молекулярної генетики, була присвячена вивченнюпроцесутрансформаціїпневмокока, відкритогоФ. Гриф- фітсом (1928). У подальшому саме мікроорганізми стали об’єктом дослідження у фундаментальних відкриттях сучасної молекуляр- ної біології і генетики, а генетика мікроорганізмів продовжує пе- ребувати в авангарді молекулярної біології і генетики.

2. КЛАСИФІКАЦІЯ ФОРМ МІНЛИВОСТІ МІКРООРГАНІЗМІВ

Мікроорганізми змінюють свої властивості в широкому діа- пазоні, причому мінятися можуть основні ознаки, які є головни- ми для ідентифікації виділеної чистої культури. На табл. 4.1. на- ведена класифікація форм мінливості мікроорганізмів (бактерій), що наочно демонструє зміни властивостей мікроорганізмів і ме- ханізми мінливості.

У мікроорганізмів (бактерій) мінливість морфологічних влас- тивостей (гетероморфізм) часто буває у разі старіння культури і під впливом дії несприятливих факторів. Бактерії можуть зміню- вати розміри та форму, втрачати рухливість, вкриватися капсу- лою або втрачати її тощо. Приклад мінливості тинкторіальних властивостей — забарвлення звичайно грамнегативних гонококів грампозитивно при хронічній гонореї у випадку тривалого ліку- вання, поява кислотопіддатливих форм мікобактерій тощо.

Найяскравішою формою мінливості бактерій зі зміною бага- тьох властивостей є S-R-дисоціація, яка виявляється перш за все в зміні морфології колоній, тобто в зміні культуральних власти- востей бактерій. Явище дисоціації було відкрито Полем де Крюї, а потім детально вивчено у працях Дж. Аркрайта.

S-R-дисоціація виникає спонтанно і зовні помітна як поява двох типів колоній. Колонії одного типу, R-колонії (англ. rough

— шорсткий), характеризуються нерівними краями і шорсткою поверхнею, мають більші розміри. Другий тип, S-колонії (англ.

80

Таблиця 4.1. Класифікація форм мінливості мікроорганізмів

За механізмом мінливості Мутаційна (спонтанні, індуковані мутації)

Адаптивна (модифікація; тривала модифікація) Комбінативна

(трансформація, трансдукція, лізогенна конверсія, кон’югація)

smooth — гладенький), має круглу форму і гладеньку поверхню. В табл. 4.2 представлено основні відмінності клітин із S- та R- колоній.

Процес дисоціації, як правило, здійснюється в одному напрям- ку — від S- до R-форми через проміжну О-форму, зворотний пе- рехід спостерігається рідко. Більшість патогенних бактерій має вірулентність в S-формі, при переході в R-форму їхня віру- лентність знижується. Часто збудник виділяється на початку за- хворювання в S-формі, а наприкінці — в R-формі, що слід врахо- вувати при бактеріологічній діагностиці.

Деякі бактерії, навпаки, є вірулентними в R-формі. До них на- лежать збудники чуми, туляремії, сибірки, туберкульозу, диф- терії, стрептокока і деякі інші.

В процесі дисоціації водночас із зміною морфології колоній змінюються біохімічні, антигенні, патогенні та інші властивості

81

Таблиця 4.2. Властивості клітин з S- і R-колоній

бактерій. Дисоціація розглядається як стереотипна пристосу- вальна реакція бактерій на вплив несприятливих факторів сере- довища. S-R-дисоціація забезпечує бактеріям селективні пере- ваги в умовах існування, що постійно змінюються. S-форми, на- приклад, більш стійкі до фагоцитозу, дії бактерицидних чинників крові, R-форми — більш стійкі в зовнішньому середовищі.

Механізм дисоціації пов’язаний з мутаційною мінливістю, най- частіше спричиненою проявом дії позахромосомних генетичних факторів.

Своєрідною формою мінливості є перехід бактерій в L-форму (L-форми дістали таку назву тому, що були відкриті в інституті ім. Д. Лістера). При переході бактерій у L-форму вони втрача- ють здатність утворювати клітинну стінку, перетворюються на гігантські кулі, які розшнуровуються на дрібні, авізуальні фор- ми, що фільтруються. У подальшому такі цикли розвитку мо- жуть повторюватися. L-форми ростуть на живильних середови- щах, утворюючи дрібні, що вростають в агар, колонії з щільним

82

центром і пінявою периферією. L-формам належить важлива роль у патології, тому що у такій формі бактерії можуть довго збері- гатися в організмі людини. Описано L-форми більшості бактерій, патогенних для людини. Можлива реверсія L-форм у початко- вий вид.

Як видно із таблиці, спостерігається мінливість усіх ознак, які вивчаються при ідентифікації бактерій. Особливе значення для одержання вакцин має мінливість біологічних властивостей бактерій. Мінливість чутливості до лікарських препаратів хоча й є несуттєвою для ідентифікації бактерій, проте відіграє важли- ву роль при антибіотикотерапії і хіміотерапії.

Діапазон мінливості може бути різноманітним, переважно внутрішньовидова неспадкова і спадкова форми мінливості, про- те еволюційний процес триває й нині, хоча часто може бути не- помітним.

3. ОСНОВНІ ПОНЯТТЯ ГЕНЕТИКИ МІКРООРГАНІЗМІВ

Перш ніж охарактеризувати механізми мінливості бактерій, нагадаємо деякі основні поняття загальної генетики, уточнивши їх щодо генетики мікроорганізмів.

Основним поняттям генетики є поняття про ген.

Ген — функціональна і структурна одиниця генотипу (ділянка

молекули нуклеїнової кислоти), що контролює синтез одного полі- пептидного ланцюга.

Матеріальною основою спадковості мікроорганізмів, як і у всіх живих істот, є нуклеїнові кислоти. У мікроорганізмів геном може бути представлений як ДНК, так і РНК (у деяких вірусів), тому йдеться про молекулу нуклеїнової кислоти в загальному вигляді. Еволюція поняття ген йшла від формули «один ген — одна ознака» до «один ген — один білок» і «один ген — один поліпептидний ланцюг». Багато функціонально активних білків складаються з кількох поліпептидних ланцюгів, причому синтез кожного з них може управлятися різними генами. Наприклад, синтез імуноглобуліну може потребувати трьох груп генів.

Генотип — система самовідтворювальних структур (генів), які контролюють обмін речовин і здійснюють передачу ознак у ряді поколінь. У цьому визначенні підкреслюється функція генотипу.

83

Фенотип — комбінація ознак у конкретних умовах існування. У фенотипі виявляється лише частина ознак, закладених у гено- типі, тому потенційні можливості генотипу завжди ширші за фе- нотипічний прояв ознак.

Генетика мікроорганізмів — це популяційна генетика. Вона вивчаєзвичайно властивості неокремихособин, апопуляції мікро- організмів. Це пов’язано не стільки зі складністю вивчення вла- стивостей окремих мікроорганізмів, скільки з тим, що мікробні популяції завжди гетерогенні і містять мікроорганізми, які інко- ли суттєво відрізняються за рядом ознак. Швидке розмноження мікроорганізмів, гаплоїдність генів, відсутність надійних ме- ханізмів стабілізації генетичного матеріалу спричинюють швидку мінливість мікробів, тому навіть клонові культури невдовзі ста- ють гетерогенними.

Ген виконує дві функції — автокаталітичну (самовідтворення для збереження ознак у ряді поколінь) і гетерокаталітичну (керу- вання обміном речовин через керування біосинтезом білків фер- ментів).

Автокаталізздійснюється шляхом реплікації нуклеїнових кис- лот. Якщо геном представлений двоспіральною ДНК (у більшості мікроорганізмів), то реплікація відбувається за на- півконсервативним типом: молекула ДНК роздвоюється на дві спіралі і йде добудова відсутньої комплементарної спіралі за допомогою ДНК-полімерази, відкритої А. Корнбергом у E. coli. В результаті утворюються дві дочірні молекули ДНК, одна з яких містить одну материнську і одну щойно синтезовану дочір- ню нитки ДНК.

Віруси можуть містити односпіральну РНК, у цьому випадку спочатку відбувається утворення реплікативної двоспіральної молекули РНК у результаті добудови комплементарної нитки РНК, а потім вже йде синтез молекул РНК вірусу. У випадку двоспіральності РНК або односпіральності ДНК у деяких вірусів реплікації відбуваються аналогічно. У будь-якому випадку за рахунок дотримання принципу комплементарності відбувається точне копіювання структури геному і збереження генів у ряді поколінь.

Гетерокаталіз реалізується через перенесення спадкової інформації від гена на структуру поліпептидного ланцюга. Зміст генетичної інформації — визначення порядку включення аміно- кислотних замісників у пептидний ланцюг — записаний у вигля- ді генетичного коду в молекулі ДНК або РНК.

84

Генетичний код характеризується такими ознаками:

1.Триплетний (одну амінокислоту кодують три нуклеотиди), що доведено під час вивчення потрійних мутантів фагів (вірусів, бактерій). Наприклад, перший відкритий триплет (УУУ) кодує включення фенілаланіну.

2.Не перекривається (нуклеотид, що входить до одного трип- лету, не може брати участь в утворенні наступного триплету).

3.Не має ком (триплети нічим не розділяються, випадіння одного нуклеотиду робить непотрібною наступну інформацію, але при випадінні повністю одного триплету зміст інформації може не загубитися, лише в цьому місці буде відсутня одна амі- нокислота).

4.Вироджений (одну амінокислоту можуть кодувати кілька різних триплетів, що забезпечує велику стійкість генетично-

ДНК- полімераза Початок гена Кінець гена реплікує ДНК

РНК-полімераза приєднується до ДНК і починає транскрипцію м-РНК

Рис. 4.1. Схема роботи гена (за D. Greenwood, R. Slack, J. Peutherer)

85

го коду, не всяка зміна триплету змінює зміст інформації). Перенесення спадкової інформації відбувається згідно з фор-

мулою Ф. Крика: ДНК → РНК → білок (рис. 4.1).

До цієї формули тепер додано процес зворотної транскрипції

— побудова ДНК-ової копії РНК за допомогою РНК-залежної ДНК-полімерази, відкритої у онкогенних вірусів Г. Теміним (1970). Процес транскрипції (побудова інформаційної РНК) і трансляції (реалізації генетичної інформації у структурі пептид- ного ланцюга) вже було розглянуто.

Регуляція біосинтезу білка здійснюється також генетично, за принципом зворотного зв’язку (рис. 4.2).

Генетичний матеріал поділяється на оперони, що включають гени-регулятори, гени-оператори і структурні гени. Ген-регуля- тор несе інформацію про синтез регуляторного білка-репресо- ра, здатного пригнічувати функціонування структурних генів за

Рис. 4.2. Схема роботи оперона (за D. Greenwood, R. Slack, J. Peutherer)

86

рахунок сполучення з геном-оператором (промотором), якщо він не з’єднаний з субстратом. При появі субстрату (наприклад, лак- този), білок-репресор з’єднується з ним і в такому стані не здат- ний репресувати гени, структурні гени депресуються, відбуваєть- ся синтез ферментів, необхідних для розщеплення субстрату. Якщо оперон управляє ферментами, які забезпечують синтез, а не розщеплення будь-якої речовини, то білок-репресор пригнічує ген-оператор лише тоді, коли він поєднаний з цією речовиною (вони містяться у надлишку). Теорія генної регуляції біосинтезу білка була створена Ф. Жакобсом і Ж. Моно при вивченні лак- тозного оперону E. сoli.

Виходячи з такого процесу регуляції біосинтезу, зрозуміло, що частина генів може перебувати у репресованому стані, а фун- кціонують лише гени, які забезпечують необхідні метаболічні процеси в даних умовах.

4. ОРГАНІЗАЦІЯ ГЕНЕТИЧНОГО МАТЕРІАЛУ БАКТЕРІЙ

На відміну від хромосоми еукаріот, спадковий матеріал прока- ріот представлений однією молекулою ДНК, нерідко замкненою у кільце. Молекулярна маса ДНК бактерій порівняно велика (у ДНК кишкової палички вона дорівнює 2·109). Генетичний матері- ал бактерій називають бактеріальною хромосомою (нуклеоїдом). Окрім нуклеоїду, генетичний матеріал у бактерій може міститися в плазмідах, транспозонах й Is-послідовностях. Ці позахромосомні спадкові елементи не є обов’язковими, але можуть надавати бак- теріям селективних переваг, наприклад, лікарської стійкості.

Плазміди— позахромосомні генетичні елементи. Це невеликі, замкнені в кільце нитки ДНК з 1,5–400 тис. пар нуклеотидів. Плаз- міди можуть перебувати у цитоплазмі в автономному, вільному стані у вигляді однієї або кількох копій, тоді вони реплікуються незалежно від хромосоми. Плазміди також можуть бути вбудо- вані до складу хромосоми, тобто перебувати в інтегрованому стані (епісоми). В цьому випадку вони відтворюються разом із хромосомою і передаються в ряді поколінь. Бактерії можуть втра- чати плазміди і отримувати їх. Плазміди містять у своєму складі ген, який забезпечує їхню здатність до передачі іншим бактері- альним клітинам, і гени, які кодують певну ознаку.

87

Нині описано кілька десятків плазмід. Розглянемо деякі з них: профаг, F-плазміда, плазміди бактеріоциногенності і R-плазміда.

Профаг може служити моделлю плазміди, оскільки здатний існувати в автономному й інтегрованому стані і не є обов’язко- вим генетичним елементом бактерій. З інтегруванням профагу в бактеріальну хромосому і набуттям бактеріями лізогенних влас- тивостей одночасно у бактерій можуть проявлятися нові влас- тивості, привнесені профагом. Цей процес називають лізоген- ною конверсією. Наприклад, дифтерійна паличка є токсигенною лише тоді, коли вона лізогенна (токсигенна конверсія).

F-плазміда, або статевий фактор (фактор фертильності, пло- довитості), має молекулярну масу близько 60·106, контролює син- тез статевих ворсинок. Бактеріальна клітина, яка має F-плазмі- ду, утворює кон’югативні ворсини, за допомогою яких встанов- люється зв’язок між F+ (чоловічими) та F– (жіночими) клітинами і за якими відбувається передача генів під час кон’югативного процесу (аналог статевого процесу у бактерій). При видаленні F-плазміди клітини втрачають властивості донорів генів і набу- вають властивостей реципієнтів — перетворення чоловічої осо- бини на жіночу. Процес кон’югації забезпечує бактеріям мож- ливість обміну генами, що є одним із важливих факторів отри- мання селективних переваг при зміні умов існування.

Бактеріоциногенні плазміди контролюють синтез антибіотич- них речовин бактеріоцинів. Ці речовини згубно діють на бак- терії того ж або близьких видів, які не мають фактора бактеріо- циногенності. Бактеріоцини виявлено у багатьох бактерій — киш- кових (коліцини), палички чуми (пестицини), стафілококів (ста- філоцини) та ін. Якщо клітина продукує бактеріоцин, вона гине, але бактеріоцини, що утворилися, впливають на формування мікробних асоціацій. Коліцини кишкової палички, наприклад, мають антагоністичну дію щодо патогенних представників киш- кової родини.

Вивчення бактеріоциногенності допомагає при типуванні бак- терій: розрізняють бактеріоциногеновари (варіанти бактерій за властивістю продукувати певний варіант бактеріоцину) і бакте- ріоциновари (варіанти бактерій за чутливістю до різних бактеріо- цинів). Це є інструментом епідеміологічного аналізу, оскільки дає можливість визначати джерела інфекції.

R-плазміда, фактор лікарської стійкості — визначає стійкість бактерій до одного або багатьох лікарських препаратів. Пере- дача R-плазмід від одних бактерій до інших спричинює їх широ-

88