obobwmju

Окремі структурні елементи бактеріальної клітини по-різно- му сприймають барвники. Спори і капсули, які мають диференці- альне значення, погано сприймають барвники і не забарвлюють- ся при звичайних методах забарвлення. Але їх можна помітити у звичайних забарвлених препаратах: спора помітна як світле тільце на фоні забарвленої цитоплазми або її залишків, капсула

— у вигляді світлого ореолу на забарвленому фоні препарату навколо інтенсивно забарвленого тіла бактерій. В діагностичній практиці застосовують спеціальні складні методи забарвлення спор і капсул.

Не сприймають забарвлення в звичайних умовах деякі бак- терії, які є кислото-спирто-лугостійкими, тобто не гинуть від дії розчинених кислот, лугів і спирту. До них належать мікобактерії туберкульозу, прокази, деякі актиноміцети. Кислотостійкість цих бактерій зумовлена високим вмістом ліпідів, наявністю міколо- вих кислот і фізико-хімічними особливостями їх клітинної стінки. У мікобактерій до 40 % сухого залишку становлять ліпіди. Вияв- лено три фракції ліпідів: фосфатидна (розчинна в ефірі), жирова (розчинна в ефірі й ацетоні) та воскова (розчинна в ефірі і хло- роформі). У складі ліпідів є різні кислотостійкі жирні кислоти: міколова, туберкулостеаринова, фтіонова та ін. Ліпіди і міко- лові кислоти зумовлюють гідрофобність клітинної поверхні, що робить клітину стійкою до дії розчинених у воді токсичних речо- вин. Ненасичені кислоти, що становлять 50 % від усієї кількості міколових кислот, залишаються рідкими навіть при низьких тем- пературах і забезпечують еластичність оболонки, необхідну для транспорту гідрофобного субстрату. Тому деякі вільноіснуючі сапрофітні мікобактерії здатні використати гідрофобні субстра- ти, зокрема парафіни нафти.

Існує залежність між кількісним вмістом міколових кислот і ступенем кислотостійкості. Кислотостійкість зберігається тільки при цілісності клітинної стінки, а поява навіть невеликого де- фекту стінки спричинює втрату кислотостійкості.

Кислотостійкість є диференціально-діагностичною ознакою, використовується для виявлення та ідентифікації бактерій. Кис- лотостійкі бактерії забарвлюють інтенсивним методом — засто- совують концентрований розчин карболового фуксину при підігріванні. Сприйнявши червоне забарвлення, кислотостійкі бактерії не знебарвлюються при обробці кислотою, лугом або спиртом. Тому після забарвлення фуксином препарат диферен- ціюють 5–10%-ю сірчаною кислотою або підкисленим спиртом і

59

після промивання водою додатково забарвлюють знебарвлені кислотопіддатливі мікроорганізми контрастним барвником, на- приклад, метиленовим синім.

Рівномірність забарвлення. Більшість патогенних бактерій за- барвлюється рівномірно, причому деталі внутрішньої структури бактеріальної клітини не виявляються. Часто видима гомо- генність забарвлення зумовлена тим, що барвник інтенсивно зв’я- зується з оболонками клітини і маскує забарвлення внутрішніх структур. Наприклад, тільки при використанні дуже розбавле- них розчинів кристалвіолету вдається отримати вибіркове забар- влення гранул волютину, тимчасом як барвник у звичайній кон- центрації дає рівномірне забарвлення клітини. Однак деякі бак- терії (палички чуми) і при звичайних методах забарвлення мо- жуть забарвлюватися біполярно, у вигляді «англійської шпиль- ки», тобто більш інтенсивно на полюсах, а центр залишається слабозабарвленим. Нерівномірно забарвлюються також споро- носні палички, оскільки спора не забарвлюється.

Метахроматичність (грец. meta — зміна, chroma — колір) —

здатність забарвлюватися в інший колір, ніж колір основного барвника. Діагностичне значення має метахроматичність зе- рен волютину в коринебактерій дифтерії. При забарвленні ме- тиленовим синім, толуїдиновим синім гранули волютину за- барвлюються у фіолетово-червоний, вишневий колір. Звичай- но для виявлення зерен волютину забарвлення здійснюють лужним метиленовим синім, при цьому волютин забарвлюєть- ся у темно-синій, а тіло клітини — в блакитний колір.

Відношення до забарвлення за Грамом. У 1884 р. Х. Грам запро-

понував метод забарвлення для виявлення деяких бактерій у тка- нинах тварин. Надалі цей метод забарвлення поширився в мікро- біології, і на відношенні до забарвлення за Грамом грунтується розділення переважної більшості бактерій на грацилікутні (грам- негативні) і фірмікутні (грампозитивні).

Забарвлення за Грамом полягає в тому, що спочатку пре- парат забарвлюють генціанвіолетом (кристалвіолетом, метил- віолетом та ін.), потім обробляють водним розчином йоду (у вигляді розчину Люголя) і диференціюють етиловим спиртом. Грампозитивні бактерії зберігають при цьому темно-фіолето- ве забарвлення, а грамнегативні знебарвлюються спиртом і потім забарвлюються розчином фуксину в контрастний черво- ний колір.

Механізм забарвлення за Грамом остаточно не з’ясований.

60

Вважають, що в його основі лежать особливості хімічного скла-

ду і будова клітинної стінки.

Клітинна стінка грампозитивних бактерій характеризується високим вмістом пептидоглікану (муреїну), який утворює товстий багатошаровий мішок, наявністю частих поперечних пептидних зв’язків між нитками глікану, наявністю в муреїновому шарі тей- хоєвих кислот, малим вмістом ліпідів. Під час обробки спиртом відбувається розбухання муреїнового шару і зменшення діамет- ра пор клітинної стінки, що знижує її проникність. Тому комп- лексна сполука генціанвіолету з речовиною цитоплазми і йодом у грампозитивних бактерій хоч і розчиняється у спирті, але не може вийти через клітинну стінку, отже, клітина зберігає пер- винне забарвлення.

Клітинна стінка грамнегативних бактерій має тонкий крупно- вічковий шар муреїну з рідкими поперечними зв’язками і містить багато ліпідів, які розчиняються і вимиваються при обробці спир- том. Тому проникність клітинної стінки вища, ніж у грампози- тивних бактерій, ще більше зростає, барвник легко вимивається спиртом, відбувається знебарвлення грамнегативних бактерій.

Доказом того, що у забарвленні за Грамом основну роль відіграє клітинна стінка, є той факт, що при порушенні цілісності клітинної стінки після обробки лізоцимом, під дією пеніциліну або внаслідок дегенерації бактерій при старінні культури грам- позитивні бактерії забарвлюються грамнегативно.

Техніку різних методів забарвлення бактерій студенти деталь- но вивчатимуть на практичних заняттях.

61

ЛЕКЦІЯ ІІІ

ФІЗІОЛОГІЯ БАКТЕРІЙ

1.Поняття про фізіологію мікроорганізмів

2.Живлення бактерій

3.Дихання бактерій

4.Ферменти бактерій

5.Культивування бактерій

6.Ріст і розмноження бактерій

7.Культуральні властивості бактерій

8.Продукти життєдіяльності бактерій

9.Роль мікроорганізмів у кругообігу речовин у природі

10.Некультивовані форми бактерій (НФБ)

1. ПОНЯТТЯ ПРО ФІЗІОЛОГІЮ МІКРООРГАНІЗМІВ

Вивчення фізіології мікроорганізмів розпочнемо з фізіології бактерій. Особливості інших груп мікроорганізмів (гриби, най- простіші, мікоплазми, хламідії, рикетсії, віруси) буде розглянуто при вивченні спеціальної медичної мікробіології. При цьому вла- стивості інших груп мікроорганізмів розглядатимуться порівня- но з властивостями бактерій.

Бактерії — одноклітинні безхлорофільні рослинні мікроорга- нізми. Вони мають досить складну будову, містять основні клітинні органоїди і складний комплекс біологічно активних мак- ромолекул. Як і всі живі організми, бактерії потребують надхо- дження з навколишнього середовища поживних речовин, які є пластичним матеріалом для побудови тіла і джерелом енергії, що забезпечує біологічні процеси в клітині. В тілі бактерій по- стійно відбуваються найскладніші біологічні процеси, в яких бе- руть участь біологічні каталізатори. Бактерії справляють знач- ний вплив на навколишнє середовище, виділяючи в нього фер- менти і продукти метаболізму. Враховуючи широке розповсю- дження в природі бактерій, їх роль у природі визначається підтри- муванням кругообігу речовин, без якого неможливе життя на

62

Землі. Патогенні й умовно-патогенні мікроорганізми, які є го- ловним предметом нашого вивчення, характеризуються най- складнішими біохімічними перетвореннями в клітинах, їхня біо- логічна активність забезпечує їм участь в інфекційному процесі.

Всі ці складні метаболічні процеси, що забезпечують життє- діяльність бактерій, їх ріст і розмноження, потребують спеціаль- ного вивчення. Цим і займається фізіологія мікроорганізмів.

Фізіологія бактерій вивчає фізичні, хімічні та біологічні проце- си в бактеріальній клітині, а також фізичні, хімічні й біологічні перетворення, спричинені бактеріями у навколишньому середовищі.

Життєдіяльність бактерій забезпечують відповідні клітинні структури (цитоплазма, оболонки, апарат ядра, органоїди) і хімічний склад. Бактерії містять воду (75–85 % у вегетативних клітинах, 40–50 % — у спорах) та сухий залишок. Вода відіграє значну фізіологічну роль, оскільки є основним середовищем для розчинення більшості клітинних компонентів. Нормальний ме- таболізм, розвиток і розмноження клітин відбуваються тільки у водній фазі навколишнього середовища.

Вода може міститися у бактеріальних клітинах у вигляді са- мостійної речовини (вільна вода) або зв’язана з компонентами клітини (з’єднана вода). Сухий залишок містить мінеральні ре- човини (2–14 %) й органічну частину, яка складається з 50–75 % білків, 10–30 % нуклеїнових кислот (ДНК і РНК), 12–28 % вугле- водів, включаючи полісахариди, 10–40 % ліпідів. Тобто власний склад бактерій мало чим відрізняється від складу будь-яких жи- вих істот на Землі. Бактерії містять основні хімічні елементи — органогени (С, H, O, P, S, N) і мікроелементи. У складі бактерій можна виявити всі відомі хімічні елементи.

2. ЖИВЛЕННЯ БАКТЕРІЙ

Для здійснення процесів росту й розмноження бактерій, тоб- то життєдіяльності, необхідні поживні речовини з навколишньо- го середовища. Надходження поживних речовин у бактеріальну клітину відбувається без енергетичних витрат, за рахунок пасив- ної дифузії (за градієнтом концентрації) або полегшеної дифузії (за допомогою ферментоподібних білків — пермеаз). Більшість поживних речовин транспортується в клітину активним шляхом, за допомогою специфічних пермеаз, локалізованих у цитоплазма- тичній мембрані. Цей процес відбувається проти градієнта кон-

63

центрації, причому кожна пермеаза переносить у клітину тільки певну речовину, процес транспорту специфічний. У процесі ак- тивного транспорту може відбуватися хімічна модифікація ре- човин, наприклад, фосфорування вуглеводів.

Необхідна обставина — сприйнятлива форма поживних ре- човин, у якій вони можуть засвоюватись мікроорганізмом. Згідно з цим розрізняють три типи живлення мікроорганізмів.

Автотрофи(автотрофи) використовують як єдине джерело вуг- лецю СО2, для гетеротрофів джерелом вуглецю є різноманітні органічні, вуглецевмісні сполуки. В свою чергу, гетеротрофи по- діляють на метатрофи (сапрофіти), які потребують відносно про- стих органічних сполук й використовують мертвий поживний матеріал, і паратрофи (паразити), які потребують складних спо- лук, що здебільшого містяться тільки в живих істотах. Патогенні мікроорганізми є метатрофами і паратрофами. Згідно з типом живлення всі бактерії поділяють, залежно від вимог до живиль- них середовищ, на невибагливі (розмножуються на загальних, універсальних, простих живильних середовищах) і вибагливі(по- требують особливих живильних середовищ).

Звичайно, для росту й розмноження бактерій недостатньо тільки поживних речовин у сприйнятливому вигляді, потрібні також вітаміни й речовини росту, різні для різних видів.

3. ДИХАННЯ БАКТЕРІЙ

Для процесів життєдіяльності бактерій необхідна енергія, яку вони отримують у результаті дихання. Сутність енергетичного метаболізму полягає в отриманні енергії, що утворюється в про- цесі біологічного окислення в аеробних і анаеробних умовах. Тому точніше назвати цей процес не диханням, а біологічним окисленням.

Дихання, абобіологічне окислення — це окисно-відновний про-

цес, що полягає в накопиченні енергії з утворенням молекул АТФ, цього універсального джерела енергії у живих організмів, яке називають також енергетичною валютою клітини.

За типом дихання всі мікроорганізми поділяють на 4 групи. 1. Облігатні аероби потребують вільного кисню у високій кон- центрації (близько 21 %). Прикладом може бути Pseudomonas

aeruginosa — синьогнійна паличка.

64

Аероби одержують енергію шляхом переносу електронів за ланцюгом окисно-відновних реакцій, в якому остаточним акцеп- тором електронів є атмосферний кисень. Цей ланцюг локалізо- ваний у цитоплазматичній мембрані аеробів та факультативних аеробів. Такий шлях енергетичного обміну дістав назву окисне фосфорилювання. Енергія одержується за рахунок формування макроергічних фосфатних зв’язків АТФ у результаті окислюван- ня субстрату з утворенням кінцевих продуктів — вуглекислого газу і води. Електронні транспортні системи бактерій звичайно локалізовані на цитоплазматичній мембрані, перенос електронів здійснюється комплексом нікотинамідних дегідрогеназ або хіно- нів і цитохромів. Аеробні бактерії мають три цитохроми (а, в, с).

Внаслідок такого окислювання з 1 моля глюкози синтезуєть- ся 38 молей АТФ із загальним запасом енергії 380 ккал (близько

55% всієї енергії одного моля глюкози).

2.Мікроаерофіли потребуютьневеликої кількості кисню, оскіль- ки висока його концентрація хоч і не вбиває бактерій, але може затримувати їх ріст. Такі бактерії не ростуть в аеробних та ана- еробних умовах, вміст кисню може дорівнювати 1–15 %. Як пра- вило, такі бактерії ростуть краще за наявності більш високої концентрації вуглекислого газу (10–15 %). Прикладом можуть бути Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, лептоспіри.

3.Виділяють такожкапнофіли (капнеїчні бактерії), наприклад, Brucella abortus — збудник бруцельозу великої рогатої худоби та людини, який у перших генераціях зростає лише у присут-

ності високої концентрації СО2.

Ріст багатьох патогенних для людини бактерій, які хоча і не належать до мікроаерофілів або капнофілів, стимулюється підви- щеним вмістом вуглекислого газу — це стафілококи, стрептоко- ки, менінгококи, гонококи тощо.

4.Факультативні анаероби, або факультативні аероби, здатні змінювати тип дихання з аеробного на анаеробний, найчастіше зустрічаються серед патогенних мікроорганізмів — коки, енте- робактерії, вібріони та багато інших. Факультативні анаероби мають один або два цитохроми.

Типовим представником факультативних анаеробів є E. coli, яка спочатку може розвиватися як анаероб, потім починає спо- живати кисень і росте як аероб, окислюючи проміжні продукти бродіння до вуглекислого газу і води.

Факультативні анаероби найбільш пристосовані до різних умов існування, тому є поширеними серед мікроорганізмів.

65

5. Облігатні анаероби отримують енергію у разі відсутності кисню, за рахунок прискореного, але не повного розщеплення поживних речовин внаслідок субстратного фосфорилювання.

Кінцевими акцепторами електронів при цьому можуть бути не- органічні сполуки (нітрати, нітрити, сульфати, карбонати, три- валентне залізо), а при процесах бродіння, які можуть бути влас- тиві не тільки анаеробам, а й мікроаерофілам і факультативним аеробам, кінцевими акцепторами електронів можуть бути органічні сполуки, наприклад, піруват, лактат тощо. Анаероби не мають цитохромів.

При анаеробному типі дихання виділяється менше енергії, тому облігатно-анаеробні мікроорганізми повинні переробляти бага- то субстрату і є біохімічно дуже активними. Наприклад, в анае- робних умовах вихід енергії з одного моля глюкози становить лише 20 ккал, замість 380 ккал внаслідок утилізації глюкози при аеробному диханні.

Длястрогих (облігатних) анаеробів, таких як збудники правця,

ботулізму, анаеробної інфекції тощо, присутність кисню діє згуб- но. Деякі анаероби, наприклад Clostridium perfringens, більшаеро- толерантні й можуть протягом короткого часу виживати, але не розмножуватися у присутності атмосферного кисню. Толеран- тність до кисню зумовлена здатністю бактерій нейтралізувати токсичні кисневі продукти (супероксид-аніон і перекис водню), які утворюються як побічні продукти при аеробному диханні. Аеробні й аеротолерантні бактерії здатні перетворювати найбільш токсичний метаболіт — супероксид-аніон — у Н2О2 за допомогою супероксиддисмутази. Потім каталаза розкладає Н2О2 на Н2О2 і О2. Каталазу мають усі аеробні бактерії, крім аеротолерантних анаеробів; суворі анаероби не мають обох фер- ментів, тому гинуть при контакті з киснем.

При культивуванні аеробів, як правило, не намагаються ство- рити спеціальні умови аерації. Мікроорганізми забезпечують знижений вміст кисню за рахунок додавання вуглекислоти з ба- лона в замкнений резервуар для культивації бактерій.

Найпростіший спосіб — запалюють ватну пробку, щільно за- кривають пробірку й заливають пробку парафіном.

Для вирощування строгих анаеробів застосовують три спосо- би культивування: в анаеростаті (спеціальний прилад, з якого можна відкачувати повітря або замінювати його на інертний газ),

в спеціальному живильному середовищі Кітта — Тароцці (про-

бірка з глюкозним бульйоном і шматочками печінки, залита звер-

66

Прилад для герметизації

Індикатор

Індикатор

Регенератор Регенератор

Рис. 3.1. Обладнання для діагностичного культивування облігат- них анаеробів:

а — Genbox (бокс на 10 чашок з живильним середовищем); б — Genbag (пакет на 1–2 чашки з живильним середовищем)

Засіяні чашки вміщують у бокс або пакет, одразу ж вкладають ре- генератор, який зв’язує О2, та індикатор, який показує рівень анае- робіозу. Герметизують за допомогою спеціальних приладів, інкубу- ють у звичайному термостаті.

ху вазеліновим маслом), в товщі глюкозного живильного агару (у

високих пробірках, трубках Буррі, трубках Віньяль — Вейона). Сьогодні для діагностичного вирощування облігатних анае- робів застосовують одноразові полімерні пакети або коробки, в яких утворюються потрібні умови відсутності кисню або підви- щеного вмісту вуглекислого газу завдяки спеціальним хімічним

регенераторам (рис. 3.1).

4. ФЕРМЕНТИ БАКТЕРІЙ

Процеси життєдіяльності здійснюються за наявності біологіч- них каталізаторів — ферментів. Для нормального розвитку і функ- ціонування типової бактеріальної клітини потрібно до 1000–4000 ферментів, які забезпечують активний транспорт поживних ре-

67

човин у клітину з навколишнього середовища, перетворення енергії та біосинтетичні процеси для забезпечення життєдіяль- ності.

Розрізняють конститутивні ферменти, які постійно перебува- ють у клітині незалежно від умов її існування та наявності суб- страту, індуктивні (адаптивні), що синтезуються тільки в тому разі, якщо існує потреба в них (вони виникають у присутності відповідного субстрату). Кожний вид мікроорганізмів має свій, властивий тільки цьому виду, набір ферментів.

Ферментативна діяльність мікроорганізмів визначає їх роль у кругообігу речовин, властивість займати певну екологічну нішу в мікробіогеоценозі. Тим же часом певний набір ферментів час- то є пізнавальною ознакою для виду мікроорганізмів. Тому фер- менти мікроорганізмів вивчають для використання їх у промис- ловості, сільському господарстві, медицині, для ідентифікації виділених культур мікроорганізмів, тобто для визначення їх ви- дової належності. Немає необхідності розбирати всі тонкощі механізму дії різних ферментів, а достатньо класифікувати фер- менти мікроорганізмів за їх субстратною специфічністю, які ре- човини (субстрати) й як змінюються під дією ферментів мікроор- ганізмів.

Таким чином, виділяють протеолітичні, сахаролітичні, ліполі- тичні ферменти, нуклеази та оксидредуктази.

Ферментативна активність мікроорганізмів (бактерій) вивчаєть- ся шляхом засіву їх на диференційно-діагностичні живильні сере- довища.

Одні ферменти бактерій локалізуються в цитоплазмі, цито- плазматичній мембрані та органоїдах клітини (ендоферменти). Інші ферменти виділяються у навколишнє середовище, здійсню- ють біохімічні перетворення поживного матеріалу до його над- ходження в клітину(екзоферменти). Внутрішньоклітинні ферменти можуть об’єднуватися функціонально і структурно в мультифер- ментні комплекси. Деякі ферменти бактерій можуть бути факто- рами вірулентності.

5. КУЛЬТИВУВАННЯ БАКТЕРІЙ

У природному середовищі і в організмі хазяїна сапрофіти й паразити самостійно знаходять собі необхідні умови для життє- діяльності. Проте інколи доводиться отримувати популяції мікро-

68