DIAMED-ID MICRO TYPING SYSTEM (инструкция по применению)

ID-карта “DAT IgG-Dilution”

Определение подклассов IgG

Данный тест может быть использован для определения приблизительного количества IgG, вызывающих сенсибилизацию клеток. Соотношение числа молекул IgG и количества эритроцитов имеет значение для определения степени риска гемолиза при аутоиммунной гемолитической анемии, гемолитической болезни новорожденных и трансфузионных реакциях.

РЕАГЕНТЫ

ID-карта “DAT IgG-Dilution” включает в себя:

• пять микропробирок, содержащих в составе гелевого матрикса 5 различных концентраций (1:10. 1:30, 1:100, 1:300, 1:1000) анти-IgG (кроличьих)

• микропробирку отрицательного контроля.

Хранить при комнатной температуре (18-25⁰С)

Срок годности указан на упаковке.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ТРЕБУЕМЫЕ РЕАГЕНТЫ

• ID-Раствор 2 - Раствор низкой ионной силы (РНИСС) для приготовления суспензии эритроцитов

• ID-DiaCell – стандартные эритроциты, готовые к применению

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОБРАЗЦА КРОВИ

Образцы крови берутся посредством стандартной венепункции. Предпочтительнее стабилизировать образцы консервантом EDTA. Для получения достоверных результатов рекомендуется использование свежезаготовленной крови.

Когда требуется использование сыворотки вместо плазмы, сыворотка должна быть хорошо очищена посредством центрифугирования в течение 10 минут (во избежание влияния остатков фибрина на течение реакции).

А. Приготовление суспензии эритроцитов для постановки прямого антиглобулинового теста (ПАТ)

Перед приготовлением суспензии эритроциты должны быть трижды отмыты (см. примечание 2).

Приготовьте 0,8 % суспензию эритроцитов в Растворе 2.

Раствор 2 должен нагреться до комнатной температуры перед использованием.

-добавьте 1 мл Раствора 2 в чистую пробирку

-добавьте 10 мкл отмытой эритроцитной массы, мягко перемешайте

-используйте полученную суспензию сразу после приготовления

В. Приготовление плазмы или сыворотки для непрямого теста Кумбса (НАТ)

В случае, когда образцы не могут быть исследованы сразу после центрифугирования, их необходимо хранить при температуре +2-8⁰С в течение не более 48 часов, дальнейшая температура хранения: -20⁰С.

ПРОЦЕДУРА ПРОВЕДЕНИЯ ТЕСТА

А. Определение IgG посредством положительного прямого антиглобулинового теста

Не используйте плохо запечатанные ID-карты с признаками высыхания геля или с пузырьками воздуха. Все используемые реагенты и исследуемые образцы должны нагреться до комнатной температуры перед использованием.

1. Промаркируйте ID-карту “DAT IgG-Dilution”, указав на ней имя пациента и номер исследуемого образца. Снимите защитную фольгу.

2. Внесите по 50 мкл суспензии эритроцитов в каждую микропробирку ID-карты

3. Центрифугируйте карту в течение 10 минут в ID-центрифуге.

4. Фиксируйте результаты реакции.

В. Определение IgG В случае получения положительного результата при постановке непрямого антиглобулинового теста

I. Постановка реакции со стандартными эритроцитами, которые выявили наличие антител при скрининге.

Не используйте плохо запечатанные ID-карты с признаками высыхания геля или с пузырьками воздуха. Все используемые реагенты и исследуемые образцы должны нагреться до комнатной температуры перед использованием.

1. Промаркируйте ID-карту “DAT IgG-Dilution”, указав на ней имя пациента и номер исследуемого образца. Снимите защитную фольгу.

2. Внесите по 50 мкл стандартных эритроцитов ID-DiaCell в каждую микропробирку ID-карты.

3. Добавьте по 25 мкл плазмы или сыворотки пациента в каждую микропробирку.

4. Инкубируйте карту в течение 15 минут при температуре 37⁰С в ID-инкубаторе.

5. Центрифугируйте карту в течение 10 минут в ID-центрифуге.

6. Фиксируйте результаты реакции.

II. Референтная процедура для анти-D, основанная на чувствительности метода 1000 IgG1 молекул / 125 IgG3 молекул

1. Приготовьте 5% суспензию эритроцитов с фенотипом ccDЕe, смешав 25 мкл эритроцитной массы и 0,5 мл изотонического раствора NaCl.

2. Внесите 0,2 мл суспензии эритроцитов в чистую пробирку.

3. Добавьте 0,4 мл сыворотки пациента (содержащей анти-D).

4. Инкубируйте карту в течение 30 минут при температуре 37⁰С.

5. Тщательно отмойте 3 раза физиологическим солевым раствором. После последнего отмывания тщательно удалите супернатант.

6. Приготовьте взвесь из осадка эритроцитов в 1,0 мл Раствора 2.

7. Промаркируйте ID-карту “DAT IgG-Dilution”, указав на ней имя пациента и номер исследуемого образца. Снимите защитную фольгу.

8. Добавьте 50 мкл взвеси эритроцитов в каждую микропробирку ID-карты “DAT IgG-Dilution”

9. Центрифугируйте карту в течение 10 минут в ID-центрифуге.

10. Фиксируйте результаты реакции.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

А) Принцип

Положительная реакция: агглютинированные эритроциты образуют красную линию на поверхности геля или распределены в его толще.

Отрицательная реакция: клетки образуют компактный осадок на дне микропробирки.

В) Реакции для IgG в ID-карте “DAT IgG-Dilution”

Степени разведения: 1:10 1:30 1:100 1:300 1:1000 ctl

2+ + - - - - Титр анти-IgG 1:30 не является существенно

важным, определение подклассов IgG не

требуется

Степени разведения: 1:10 1:30 1:100 1:300 1:1000 ctl

3+ 3+ 2+ 1+ - - Титр анти-IgG 1:300 является клинически

значимым, требуется определение подклассов

IgG, существует риск гемолиза

ПРИМЕЧАНИЯ

1) Важно заметить, что прогнозы о возможности развития гемолиза или ГБН должны также делаться на основании клинического состояния больного, его истории болезни и других лабораторных исследований.

2) При получении положительного результата в микропробирке отрицательного контроля (ctl) требуется проведение следующих процедур:

-Отмойте эритроциты теплым (37⁰С) 0,9 % изотоническим солевым раствором (или Раствором 2), затем выполняйте процедуры, описанные в разделе «Приготовление образца крови».

3) Если микропробирка отрицательного контроля показывает положительную реакцию при определении подклассов IgG при положительном непрямом антиглобулиновом тесте по причине наличия сильно агглютинирующего антитела (например, анти-Д), необходимо определить титр антител в нейтральном геле для установки степени разведения, при которой не происходит спонтанная агрегация.

ОГРАНИЧЕНИЯ

-Некоторые лекарственные препараты могут вызывать положительную реакцию при постановке теста Кумбса.

-Некоторые патологические состояния могут так же вызывать положительную реакцию при постановке теста Кумбса.

-Бактериальное или другое загрязнение используемого материала может вызвать ложноположительную или ложноотрицательную реакцию.

-Остатки фибрина во взвеси эритроцитов могут задерживать неагглютинированные клетки. В этом случае на поверхности геля будет определяться тонкая розовая линия, тогда как большинство клеток после центрифугирования локализуется на дне микропробирки.

-Необходимо строго следовать описанной технике выполнения процедуры и использовать рекомендуемое оборудование. Важно регулярно проверять оборудование в соответствии с процедурами GLP .

-Использование других суспензионных растворов для эритроцитов вместо раствора ID-Diluent 2 может изменить результаты реакции.

-Слишком концентрированная или слишком слабая суспензия красных клеток может стать причиной получения ложных реакций.