Выявление антиэритроцитарных антител.

Исследуемые сыворотки и стандартные эритроциты для выявления антител добавляются в верхнюю часть микропробирок. После инкубации и центрифугирования агглютинированные эритроциты остаются в верхней части пробирки, так как не проходят через гель из-за большого размера агглютинатов (положительный результат). При отсутствии антител к антигенам тест-эритроцитов агглютинаты не образуются. Неагглютинированные эритроциты легко проходят через гель и оседают на дне пробирки (отрицательный результат). Характер агглютинации при выявлении антител к эритроцитам зависит от титра антител, их активности и оценивается от 4+ до +.

Скрининг антител выполняется как в нейтральном геле, так и в геле, содержащем антиглобулиновый реагент. В первом случае для исследования берутся обработанные ферментом эритроциты, во втором – суспензия эритроцитов в растворе низкой ионной силы. Скрининг и идентификация антител производятся с помощью стандартной панели эритроцитов. При оценке эффективности гелевого теста была установлена его более высокая чувствительность по сравнению с традиционными методиками.

Id-карты, используемые для скрининга антител:

ID-карты	Конфигурация
ID-DiaScreening	4 AHG tests/2 enzyme tests
LISS Coombs + Enzyme test	3 AHG tests/3 enzyme tests
LISS/Coombs	6 AHG tests
Coombs anti-IgG	6 AHG anti-IgG tests
NaCl, Enzyme test and cold agglut.	6 enzyme tests (or 6 NaCl tests)

Id-карты, используемые для идентификации антител:

ID-карты	Конфигурация
LISS/Coombs	6 AHG tests
NaCl, Enzyme test and cold agglut.	6 enzyme tests (or 6 NaCl tests)
Coombs anti-IgG	6 AHG anti-IgG tests

Методы исследования антител к антигенам эритроцитов.

Антиглобулиновый тест (непрямая реакция Кумбса).

Непрямой антиглобулиновый тест (НАТ) используется для выявления антиэритроцитарных антител. Постановка непрямого антиглобулинового теста в гелевом тесте не требует отмывания эритроцитов.НАТ используется для:

- определения в сыворотке реципиента антител к эритроцитам донора – при постановке пробы на совместимость;

- при скрининге «неожиданных» антиэритроцитарных антител;

- при исследовании антиэритроцитарных антител у беременных;

- при исследовании антител в сыворотке больных аутоиммунной гемолитической анемией.

Ход определения:

- внести в три микропробирки ID-карты по 50 мкл стандартных (типированных) эритроцитов;

- добавить в микропробирки по 25 мкл исследуемой сыворотки;

- инкубировать в течение 15 мин. при температуре 37^о;

- центрифугировать ID-карты в течение 10 мин.;

- оценить результат исследования: положительный результат свидетельствует о наличии иммунных (алло-) антител в исследуемой сыворотке или плазме (для выяснения специфичности антител используют таблицу, прилагаемую к стандартным эритроцитам). Отрицательный результат свидетельствует об отсутствии иммунных антител в исследуемой сыворотке или плазме.

Ферментный метод.

Обработка протеолитическими ферментами повышает агглютинабельность эритроцитов.

Ход определения:

- внести в три микропробирки ID-карты по 50 мкл взвеси стандартных типированных эритроцитов, обработанных протеолитическим ферментом (ID-DiaCellI-II-IIIP);

- добавить в микропробирки по 25 мкл исследуемой сыворотки;

- инкубировать в течение 15 мин. при температуре 37^оС;

- центрифугировать ID-карты в течение 10 мин.;

- оценить результат исследования (см. антиглобулиновый тест).

Метод холодовой агглютинации.

Ход определения:

- выдержать стандартные эритроциты и ID-карты в течение 30 мин. при температуре 2 – 8^оС;

- внести в три микропробирки по 50 мкл. стандартных эритроцитов;

- добавить по 25 мкл. исследуемой сыворотки;

- инкубировать в течение 30 мин. при температуре 2 – 8^оС;

- центрифугировать ID-карты в течение 10 мин.;

- оценить результат исследования: положительный результат свидетельствует о наличии холодовых антител в исследуемой сыворотке или плазме.

При наличии в исследуемой сыворотке холодовых или тепловых аутоантител могут наблюдаться ложноположительные результаты. Для исключения таких результатов необходимо поставить аутоконтроль:

- приготовить 0.8% взвесь эритроцитов исследуемой крови в растворе для разведения 2, добавив к 1 мл. раствора для разведения 2 10 мкл. цельной крови;

- внести по 50 мкл. приготовленной взвеси эритроцитов в микропробирку ID-карты для реакции Кумбса или для ферментного метода и холодовой агглютинации;

- в микропробирки ID-карты внести по 25 мкл. исследуемой сыворотки (для ферментного метода необходимо внести еще по 25 мкл. раствора для разведения 1);

- карты инкубировать 15 мин. при температуре 37^оС (для реакции Кумбса и ферментного метода) или при температуре 2–8^оС (для постановки аутоконтроля холодовой агглютинации).

Положительный результат в аутоконтроле свидетельствует о присутствии в исследуемой сыворотке аутоантител.