IV. Методы серологических исследований

1. Определение групповой принадлежности сыворотки при помощи стандартных эритроцитов.

Определение производится на белой фарфоровой или любой другой белой пластинке со смачиваемой поверхностью, на которой надписываются обозначения: слева "О", в середине "А" и справа "В". Соответственно каждому обозначению на пластинку наносят по одной маленькой капле (0,01 мл) стандартных эритроцитов групп 0(I), А(II), и В (III). На каждую каплю эритроцитов капают одну большую каплю (0,1 мл) испытуемой сыворотки с тем, чтобы соотношение количества эритроцитов и сыворотки было приблизительно 1:10. Эритроциты перемешивают с сывороткой сухой стеклянной палочкой, пластинку слегка покачивают, затем на 1-2 минуты оставляют в покое, потом снова покачивают и одновременно наблюдают результат. Наблюдение проводят в течение 5 минут. Через 3-5 минут в каждую каплю, в которой наступила агглютинация, добавляют 1 каплю (0,1 мл) изотонического раствора NaCl и снова покачивают пластинку.

Результат учитывают по наличию или отсутствию агглютинации в каждой капле. При этом возможны четыре варианта:

- агглютинация наступила с эритроцитами групп А(II) и В (III), но отсутствует с эритроцитами группы 0(I). Это указывает на наличие в испытуемой сыворотке двух агглютининов альфа (анти-А) и бета (анти-В), т.е. на принадлежность испытуемой сыворотки к группе О альфа бета(I);

- агглютинация наступила с эритроцитами группы B(III) и отсутствует с эритроцитами групп O(I) и A(II). Это указывает на наличие в испытуемой сыворотке только агглютинина бета (анти-В), т.е. на принадлежность испытуемой сыворотки к группе А бета(II);

- агглютинация наступила с эритроцитами группы А(II) и отсутствует с эритроцитами групп О(I) и В(III). Это указывает на наличие в испытуемой сыворотке только агглютинина альфа (анти-А), т.е. на принадлежность испытуемой сыворотки к группе В альфа(III);

- агглютинация отсутствует с эритроцитами всех трех групп. Это указывает на отсутствие групповых агглютининов, т.е. на принадлежность испытуемой сыворотки к группе АВ (IV).

2. Определение способности сыворотки вызывать неспецифическую агглютинацию.

Эти исследования можно проводить одновременно с определением групповой принадлежности при помощи стандартных эритроцитов.

Дополнительно в исследование включают 6-8 образцов эритроцитов группы О(I) и одногруппных с исследуемой сывороткой.

Наблюдение результатов с эритроцитами одноименной группы и группы О(I) проводят до 20 минут.

Если испытуемая сыворотка вызывает агглютинацию эритроцитов одноименной группы и группы О(I), это значит, что она обладает свойством вызывать неспецифическую агглютинацию. В этих случаях учитывают скорость ее наступления и интенсивность.

3. Определение гемолизирующих свойств сыворотки.

Гемолизирующие свойства сыворотки выявляются одновременно с определением групповой принадлежности при помощи стандартных эритроцитов. Если при смешивании с эритроцитами сыворотка вызывает их гемолиз, значит сыворотка обладает гемолизирующими свойствами.

4. Определение скорости наступления агглютинации.

Скорость наступления агглютинации определяют так же, как групповую принадлежность - при помощи стандартных эритроцитов, но с дополнительным включением в реакцию стандартных эритроцитов группы А2. Скорость наступления агглютинации учитывают с помощью секундомера от момента перемешивания сыворотки с эритроцитами до момента наступления первых признаков агглютинации отдельно по отношению к эритроцитам групп А1, А2 и В.

5. Определение титра агглютининов.

Для определения титра агглютининов в исследуемой сыворотке приготавливают разведения ее в изотоническом растворе NaCl. Для этого в штатив ставят 10 пробирок и в каждую из них вносят градуированной пипеткой по 1 мл изотонического раствор NaCl. Затем в первую пробирку той же пипеткой добавляют 1 мл испытуемой сыворотки и перемешивают ее с изотоническим раствором путем встряхивания пробирки. Из этой пробирки 1 мл смеси переносят во вторую и снова перемешивают и так до последней пробирки. В результате в пробирках образуются разведения сыворотки от 1:2 до 1:1024.

Непосредственно на пластинке можно приготовить разведения сыворотки в арифметической прогрессии. Для этого следует сделать в пробирке первое исходное разведение (любое).

Например, к одной капле сыворотки добавить 15 капель изотонического раствора хлорида натрия, получив таким образом разведение 1:16. Эту разведенную сыворотку нанести в 6 пронумерованных точек на пластику: в первую точку 2 капли, во вторую, третью и все последующие - по 1 капле. Затем добавить изотонический раствор: во вторую точку 1 каплю, в третью - 2 капли, в четвертую - 3 капли, в пятую - 4 капли, в шестую - 5 капель. Капли перемешивают стеклянной палочкой, начиная с последней точки в направлении к первой. Так получают разведения сыворотки на пластинке: 1:16, 1:32, 1:48, 1:64, 1:80, 1:96.

При определении титра агглютинина альфа2 по отношению к эритроцитам А2 приготавливают дополнительно промежуточное разведение сыворотки 1:24.

Разведения сыворотки можно приготовить, отмеряя сыворотку и изотонический раствор NaCl каплями, для чего используют одну и ту же пипетку.

На пробирках отмечают степень разведения сыворотки. Далее 0,1 мл (одну большую каплю) каждого разведения сыворотки переносят на пластинку, предварительно надписав на ней обозначения степени разведения сыворотки 1:2, 1:4 и т.д. до 1:1024.

Разведения сыворотки можно приготавливать также непосредственно на пластинке. Для этого в десять пронумерованных точек наносят по одной большой капле (0,1 мл) изотонического раствора NaCl, в первую точку добавляют одну каплю (0,1 мл) испытуемой сыворотки, перемешивают капли, затем той же пипеткой переносят одну каплю смеси во вторую точку и т.д. до десятой, получая таким образом разведения сыворотки от 1:2 до 1:1024.

На пластинку рядом с каждой каплей разведенной сыворотки наносят маленькую каплю (0,01 мл) стандартных эритроцитов соответствующей группы, т.е. эритроциты А, и А2, когда титруют агглютинины альфа и эритроциты группы В, когда титруют агглютинины бета. Соотношение эритроцитов и сыворотки должно быть 1:10.

Каждую каплю стандартных эритроцитов тщательно перемешивают с сывороткой сухой стеклянной палочкой, после чего пластинку покачивают, затем оставляют на 1-1,5 минуты в покое, снова покачивают и одновременно наблюдают результат в течение 5 минут.

Наибольшее разведение сыворотки, в котором наступила агглютинация стандартных эритроцитов до истечения 5 минут, принимают за титр агглютининов в этой сыворотке.