14-15 Матричные биосинтезы

2

Хроматин уложен в виде сферических частиц – нуклеосом, соединенных друг с

другом нитью ДНК. Нуклеосома представляет собой комплекс участка молекулы ДНК и восьми молекул гистонов. В составе нуклеосомы находятся по 2 молекулы гисто-

нов Н2α, Н2β, Н3, Н4. Нить ДНК последовательно контактируя с гистонами Н2α, Н2β,

Н4, Н3, Н3, Н4, Н2β, Н2α, наматывается на гистоновое ядро, которое "маскирует" 146 пар оснований ДНК. Гистон Н1 связывается с нуклеосомой на участке входа и

выхода ДНК, "склеивая" 2 оборота и "маскируя" еще 20 пар оснований. Всего за-

маскировано 166 пар оснований. Кроме нуклеосом, в ядре присутствуют еще 2

структуры: фибриллы диаметром 10 нм, состоящие из цепочки нуклеосом, и волокна, диаметром 30 нм, образующиеся при закручивании фибрилл в спираль. На виток спирали приходится 6-7 нуклеосом. Участок ДНК между нуклеосомами называется спейсерным (англ: space – пространство), его длина варьирует в зависимости от вида организма и типа клеток. У человека она составляет около 50 пар нуклеотидов.

Благодаря наличию нуклеосом достигается уменьшение размеров хромосомы в 7 раз, далее происходит укладка в суперспираль и „суперсуперспираль". Таким образом, благодаря гистонам размеры ДНК уменьшаются в тысячи раз: если длина ДНК достигает 6-9 см (10-1), то размеры хромосом – всего несколько микрометров (10-6).

Хроматин может быть активным (эухроматин) и неактивным (гетерохроматин). Активный хроматин содержит активные гены, т.е. те гены, с которых считывается информация. В активном хроматине нуклеосомная структура изменена или вообще отсутству-

ет, благодаря чему ДНК становится доступной для со-

ответствующих ферментов.

СТРОЕНИЕ РИБОНУКЛЕИНОВЫХ

КИСЛОТ

Рибонуклеиновая кислота (РНК) представляет со-

бой последовательность рибонуклеозидмонофосфа-

тов, связанных друг с другом 5’-3’-фосфодиэфирными связями. РНК отличается от ДНК однонитевой струк-

3

турой, наличием урацила вместо тимина и рибозы вместо дезоксирибозы

В клетке присутствует четыре типа РНК:

Рибосомальные РНК (рРНК) у прокариот и эукариот различны и отличаются величиной седиментации (S, величиной скорости оседания молекулы). У прокариот три

разновидности рРНК: 5S, 16S и 23S. У эукариот четыре разновидности: 5S, 5,8S, 18S

и 28S. Рибосомальные РНК участвуют в построении рибосом, внутриклеточных белоксинтезирующих органелл.

Рибосомы состоят из двух неравных субчастиц, малой и большой.

Упрокариот

•малую (30S) субчастицу образуют белки, 23S-рРНК и 5S-рРНК;

•большую (50S) – белки и 16S-рРНК.

Уэукариот

•малую (40S) субчастицу образуют белки и 18S-рРНК,

•большую (60S) – белки и 5S-, 5,8S-, 28S-рРНК.

Матричные РНК (мРНК) представляют собой линейную последовательность нуклеотидов. К 5’-концу молекулы присоеди-

нен метилгунозиндифосфат, на 3’-конце име-

ется полиадениловая последовательность. Их функция – информационная, т.е. перенос информации о структуре белков от ДНК к месту

их синтеза.

Транспортные РНК (тРНК) бактерий и эу-

кариот включают 73-93 нуклеотида. Они пере-

носят аминокислоты из цитозоля к рибосомам. Вторичная структура тРНК напоминает кле-

верный лист, а третичная – латинскую букву L.

В «клеверном листе» выделяют четыре участка (или ветви, петли), каждый из которых име-

ет собственную функцию: антикодоновый,

псевдоуридиловый, дигидроуридиловый, акцепторный. На 5’-конце тРНК находится гуани-

ловый нуклеотид, на 3’-конце – триплет Ц-Ц-А.

• • Малые РНК – используются для созревания мРНК и некоторых других клеточ-

ных процессов.

РЕПЛИКАЦИЯ ДНК

Синтез ДНК в клетке происходит не беспорядоч-

но, а в строго определенный период жизни клетки.

Всего выделяют 4 фазы: митоз (М), синтетическую (S), пресинтетическую (G1, от англ. gap - интервал),

постсинтетическую (G2).

Важное участие в регуляции смены фаз клеточного цикла занимают циклины – белки массой

35-90 кДа, уровень которых меняется в ходе клеточ-

ного цикла. По функции циклины – это активаторные

субъединицы ферментов циклин-зависимых киназ (ЦЗК). Активные комплексы циклин-ЦЗК фосфорили-

руют внутриклеточные белки, изменяя их активность. Этим обеспечивается продвижение по клеточному циклу.

5

По мере расплетания и движения репликативной вилки на нити открываются

участки, где возможен синтез новой нити в направлении 5' → 3'.

Направление 5' → 3' другой материнской нити ДНК совпадает с направлением движения репликативной вилки. Поэтому синтез дочерней нити (в направлении 5' → 3') возможен только после расплетания части ДНК и освобождения участка для синтеза.

Таким образом, синтез дочерней ДНК на одной из нитей материнской ДНК идет фрагментарно. По имени японского исследователя синтезируемые на отстающей цепи отрезки ДНК назвали фрагменты Оказаки.

6

В целом для синтеза ДНК необходим ряд ферментов.

Ферменты репликации эукариот и их функция

Роль ферментов репликации ДНК

7

Дополнение – движение репликативной вилки и синтез нитей ДНК:

8

ПОВРЕЖДЕНИЯ И РЕПАРАЦИЯ ДНК.

Так как на геном любой неделящейся клетки постоянно оказывает влияние окру-

жающая среда, то вполне вероятны повреждения в составе генома: изменение нуклеотида (например, дезаминирование), сшивки азотистых оснований друг с другом,

разрывы цепей, отрыв пуриновых нуклеотидов и т.п. Такие изменения быстро опре-

деляются специальными ферментами, пораженный участок удаляется экзонуклеа-

зами, заполняется ДНК-полимеразой β и сшивается ДНК-лигазой.

В делящейся клетке мутации могут также возникать во время синтеза ДНК. По-

этому в клетках существует двойная система проверки точности репликации: одна непосредственно при ДНК-полимеразной реакции, другая – анализ уже синтезиро-

ванной ДНК.

ГИБРИДИЗАЦИЯ ДНК– ДНК И ДНК– РНК

Если нагреть раствор ДНК выше температуры 90°С или сдвинуть рН в резко ще-

лочную или резко кислую стороны, то водородные связи между нитями ДНК разру-

шаются, двойная спираль расплетается. Происходит денатурация ДНК или, подругому, плавление. Если удалить агрессивный фактор, то происходит ренатура-

ция или отжиг. При отжиге нити ДНК "отыскивают" комплементарные участки друг у друга и, в конце концов, вновь сворачиваются в двойную спираль.

Если в одной "пробирке" провести плавление и отжиг смеси ДНК человека и мы-

ши, то некоторые участки цепей ДНК мыши будет воссоединяться с комплементар-

ными участками цепей ДНК человека с образованием гибридов. Число таких участков зависит от степени родства видов. Чем ближе виды между собой, тем больше

участков комплементарности нитей ДНК. Это называется гибридизация ДНК-ДНК.

Если в растворе присутствует РНК, то можно осуществить гибридизацию ДНКРНК. Это помогает установить близость определенных последовательностей ДНК с

какой-либо РНК.

Гибридизация ДНК-ДНК и ДНК-РНК используется как эффективное средство в молекулярной генетике.

Например, на основе знания белковой последовательности можно искусственно синтезировать РНК. При гибридизации такой РНК с

образцами ДНК вполне реально определить участок ДНК, ответ-

ственный за синтез исходного белка.

ТРАНСКРИПЦИЯ

Транскрипция (англ. transcription – переписывание), – это биосинтез РНК на мат-

рице ДНК. Биосинтез РНК происходит в участке ДНК, который называется транс-

криптом, с одного края он ограничен промотором (начало), с другого – терминатором (конец).

Как в любом матричном биосинтезе в транскрипции выделяют 5 необходимых элементов:

•матрица – одна из цепей ДНК

•растущая цепь – РНК

•субстрат для синтеза – рибонуклеотиды (УТФ, ГТФ, ЦТФ, АТФ)

•источник энергии – УТФ, ГТФ, ЦТФ, АТФ

•ферменты – РНК-полимеразы.

9

Существует три основных типа РНК-полимераз: для синтеза пре-рРНК (РНК-

полимераза I), для синтеза пре-мРНК (РНК-полимераза II), для синтеза пре-тРНК и

5S-рРНК (РНК-полимераза III).

В составе РНК-полимеразы E.coli выделяют четыре субъединицы: две

α-субъединицы, по одной β- и β’-субъединице. Имеется также дополнительный бел-

ковый σ-фактор Последний необходим только для связывания с промотором и не участвует в удлинении цепи РНК.

Строение РНК-полимераз эукариот имеет много общего со структурой бактери-

ального фермента: они имеют по две больших субъединицы и несколько малых субъединиц.

СТАДИИ ТРАНКРИПЦИИ

Инициация

Промотор содержит стартовый сигнал транкрипции ТАТА-бокс – определенную

последовательность нуклеотидов ДНК, присоединяющий инициирующий ТАТА-фактор. Этот ТАТА-фактор обеспечивает присоединение РНК-полимеразы к

той нити ДНК, которая будет использоваться в качестве шаблона для транскрипции.

Так как промотор ассиметричен, то он связывает РНК-полимеразу только в одной

ориентации, что определяет направление транскрипции от 5’-конца к 3’-концу

(5’ → 3’).

Другие факторы инициации раскручивают спираль ДНК перед РНК-полимеразой. После синтеза затравочного фрагмента РНК длиной 8-10 рибонуклеотидов

σ-фактор отрывается от фермента.

Элонгация

Белковые факторы элонгации обеспечивают продвижение РНК-полимеразы

вдоль ДНК и расплетание нитей ДНК на протяжении примерно 17 нуклеотидных пар. РНК-полимераза продвигается со скоростью примерно 40-50 нуклеотидов в секунду

в направлении 5’ → 3’. Используя одновременно в качестве субстрата и источника

энергии АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ.

Терминация

РНК-полимераза остановится, когда достигнет терминирующих кодонов. С по-

мощью белкового фактора терминации, так называемого ρ-фактора (греч. ρ - "ро"),

от матрицы ДНК отделяются фермент и синтезированная молекула РНК, которая

является первичным транскриптом, предшественником мРНК или тРНК или рРНК.

10

ПРОЦЕССИНГ РНК.

Снтезированные молекулы РНК являются и в дальнейшем претерпевают ряд

изменений, которые называются процессингом. У эукариот процессингу подвергаются все виды пре-РНК, у прокариот – только предшественники рРНК и тРНК.

ПРОЦЕССИНГ ПРЕДШЕСТВЕННИКА МРНК

1.Кэпирование (англ. c a p - шапка) – происходит еще во время транскрипции,

состоит в том, что к 5’-трифосфату концевого нуклеотида пре-мРНК присоединяется

5’-углерод N7-метил-гуанозина. «Кэп» необходим для защиты молекулы РНК от

5’-3’-экзонуклеаз.

2. При транскрипции зон ДНК, несущих ин-

формацию о белках,

образуются гетерогенные ядерные РНК, по

размеру намного пре-

восходящие мРНК. Де-

ло в том, что из-за мо-

заичной структуры генов эти гетерогенные

РНК включают в себя

информативные (экзоны) и неинформативные

(интроны) участки. При

встык) происходит удаление интронов и со-

хранение экзонов.