ГБОУ ВПО СибГМУ Министерство здравоохранения РФ Кафедра биохимии и молекулярной

Проточная цитометрия — метод исследования дисперсных сред в режиме поштучного анализа элементов дисперсной фазы по сигналам светорассеяния и флуоресценции. Название метода связано с основным приложением, а именно, с исследованием одиночных биологических клеток в потоке.

Принцип метода проточной цитометрии основан на регистрации флюоресценции и светорассеяния от каждой отдельно взятой клетки в клеточной суспензии. Суспензия клеток под давлением подается в проточную ячейку, где за счет разности давлений между образцом и обтекающей жидкостью клетки, находясь в ламинарном потоке жидкости, выстраиваются в цепочку друг за другом (т.н. гидродинамическое фокусирование)

Клетки одна за другой проходят через лазерный луч, а высокочувствительные детекторы, расположенные вокруг проточной ячейки регистрируют флюоресценцию и рассеяное лазерное излучение каждой клетки. Полученный сигнал передается в компьютер, обрабатывается, и полученные данные отображаются в виде различных графиков и гистограмм.

Параметры, клеток регистрируемые при помощи

проточного цитометра

Прямое (малоугловое) светорассеяние - forward scatter. Детектор прямого светорассеяния располагается по ходу лазерного луча за проточной ячейкой и регистрирует излучение разера, которое рассеивается под углами 2-19 градусов. Интенсивность рассеянного под малым углом света пропорциональна размеру клетки. Более крупные клетки рассеивают свет сильнее мелких.

Боковое светорассеяние - side scatter. Внутреннее содержимое клеток оптически неоднородно. Луч лазера, проходя сквозь клетку, многократно преломляется и рассеивается во все стороны. Регистрация этого излучения позволяет судить о сложности внутреннего строения клетки (соотношение ядро-цитоплазма, наличие гранул, других внутриклеточных включений). Комбинация бокового и прямого светорассеяния позволяет судить о морфологии клетки в целом, выделять различные популяции клеток (лимфоциты,

для дальнейшего

Регистрация флуоресценции. Система для регистрации свечения флюоресцентных меток состоит из комплекса светофильтров и фотоумножителей, каждый из которых регистрирует излучение в диапазоне длин волн, соответствующих флуорохрому. Выбор типа и количества флуоресцентных красителей определяется поставленной задачей для данного исследования.

Основными типами таких красителей являются моноклональные антитела, коньюгированные с флюоресцентной меткой (FITC, PE, APC, PerCP и др.) для определения мембранных и цитоплазматических антигенов клетки, красители, позволяющие оценить жизнеспособность клеток (7AAD, PI)флуорофоры, связывающиеся с нуклеиновыми кислотами (DAPI, Hoechst), pH-чувствительные флуорофоры (Fluo-3), ион-зависимые флуорофоры (Indo-1). Полученные данные обрабатываются компьютером и отображаются в виде одномерных гистограмм или двух- и трехмерных точечных или плотностных графиков. Анализ данных позволяет определить количество клеток, отвечающих тем или иным условиям, оценить интенсивность флуоресценции (т.е. плотность того или иного маркера на поверхности клетки). В некоторых случаях при помощи проточного цитометра можно определить абсолютное число клеток в исследуемом образце.

Сортировка клеток. В проточном цитометре, оборудованном системой для сортировке клеток, проточная ячейка закреплена на пьезокристалле. При подаче на него напряжения кристалл вместе с ячейкой совершает колебания с заданой частотой, в результате чего струя жидкости с клетками разбивается на отдельные капли. Проходя сквозь заряжающее кольцо, капля может приобретать положительный или отрицательный заряд в зависимости от того, какая клетка содержиться внутри капли. Пролетая мимо отклоняющих пластин капля с клеткой притягивается к ним, выходит из основного потока и попадает в пробирку.

Преимуществами сортировки клеток на проточном цитометре является высокая чистота получаемой популяции клеток (до 99.9% позитивных клеток в отсортированной фракции), возможность сортировать клетки по любым комбинациям детектируемых параметров. Данный метод позволяет отсортировывать любое количество клеток, вплоть до единичных клеток, что является незаменимым в технологиях связанных с клонированием. Проходя через системы прибора клетки подвергаются некоторым неблагоприятным воздействиям (лазерное излучение, перепады давления) что несколько снижает процент жизнеспособных клеток на выходе по сравнению с исходнам материалом. Также при сортировке

Оптическая система для измерения интенсивности как собственной флуоресценции клеток, так и после их предварительного окрашивания флуоресцентым

красителем

В настоящее время синтезированы флуоресцентные красители, которые имеют максимумы возбуждения в диапазоне 400 - 650 нм. Их флуоресценция (вторичный световой поток) имеет определенную длину волны. Часто изучаемые клетки окрашивают сразу несколькими красителями. Как результат – флуоресценция (вторичный световой поток)

является полихромным. Оптический канал позволяет выделить из общего потока флуоресценции все его составляющие (каждый из которых имеет определенную длину волны) и измерить их интенсивность.