ЛЕКЦИЯ 2.2
ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ
СПЕКТРОСКОПИЯ
(ФЛУОРИМЕТРИЯ)
Люминесценция – способность многих органичес- ких и неорганических веществ к самостоятельному свечению, которое возникает в результате различ- ных внешних воздействий.
Люминесценция (англ. luminescence) –
- свечение.
Термин введен Видеманом в 1889 году.
Типы люминесценции
ФОТОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ
свечение под влиянием света (УФ- и видимого)
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Флуоресценция |
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ |
|
|||||
|
|
|
|
10-9 - 10-6 с |
|
|
||||
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
свечение, исп |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
Фосфоресценция |
|
|
энергию хим. |
|
||||||
|
|
|
= 10-3 - 10-1 с |
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
способность живых организмов |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
светиться, достигаемая само- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
стоятельно или с помощью |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
симбионтов. |
|
Флуоресценция (частный случай люминесценции), широко распространена в природе и может происхо- дить в газах, растворах и твёрдых телах.
Флуоресценция – испускание света молекулой- флуорофором (вторичный световой поток), возбуж- дённой световым излучением (первичный световой поток). Вторичный световой поток возникает при переходе молекул флуорофора из возбужденного электронного состояния (S1) в основное (So).
Флуоресценция прекращается сразу при исчезно- вении возбуждающего светового потока. (Затухание флуоресценции в этих условиях происходит в тече-
нии наносекунд).
Флуорофор – молекула или фрагмент молекулы, придающий ей флуоресцентные свойства.
Как правило, флуорофором является карбо- или гетероциклическая структура, которая поглощает квант светового потока с определённой энергией (определенной длины волны).
Количество энергии (длина волны) излучаемого света зависят от химической природы флуорофора и от параметров его окружения (вязкость, поляр- ность и др.).
Флуорофоры
ЭНЕРГИЯ ЭЛЕКТРОНОВ
Природа флуоресценции
(диаграмма Яблонского - энергия электронов в основном и возбужденном состояниях при флуоресценции)
S2, второе |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
S2 |
|
|
|
|
|
|
|
Потеря части энергии |
||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
за счет взаимостолкновений |
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||
возбужд. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
молекул и атомов (вибрационная |
||||||||||
состояние |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
релаксация), = 10-15 с |
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
S1 |
Испускание оставшейся |
S1, первое |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
энергии в виде вторичного |
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||||||||
возбужд. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
светового излучения. |
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||
состояние |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Длительность флуресценции |
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
одной возбужденной молекулы |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ h |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
флуорофора, = 10-8 с |
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Излучаемые h |
|||||||||
So |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
вторичное излучение |
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
(вторичный световой поток) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Энергия излучаемых h всегда |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
меньше энергии |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Основное |
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
возбуждающих h сдвиг Стокса |
||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
состояние, So |
|||||||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|||||||||||||||||||||||||||||||
Диаграмма Яблонского
S2
= 10-15 с
S1
= 10-8 с)
fluorescence
So
Устройство спектрофлуорметра |
||
|
(вид сверху) |
|
|
|
Кювета с |
|
возб. |
образцом |
|
|
Вторичное |
|
|
излучение – |
Монохроматор 1 |
- флуоресценция |
|
Выделяет , которая |
|
|
максимально поглощается |
Монохроматор 2 |
|
веществом |
|
|
|
Выделяет при |
|
|
|
|
|
|
которой Fф |
Две лампы |
|
максимальна |
для обеспечения полно- |
|
флуор. |
диапазонного светового |
|
|
потока в УФ и видимой |
ФЭУ |
|
областях спектра |
|
|
|
|
|
Измерение Fф
Спектры возбуждения и спектры флуоресценции
Спектр возбуждения - зависимость количества поглощенного света от длины волны (то же, что спектр поглощения).
Спектр флуоресценции – интенсивность флуо- ресценции (Iф), измер. при различных длинах волн.
Е, Iф |
сдвиг Стокса |
||
|
|
|
|
Возб. Флуор.
Возб. Флуор.
Сдвиг Стокса – энергия кванта флуоресценции всегда меньше энергии кванта возбуждения – - mах. флуоресценции
сдвинут в длинноволновую область