2. Проникающая хроматография

синонимы: гель-ХГ, гель-фильтрация (не путать с ультафильтрацией), молекулярно-

ситовая ХГ.

В основе принципа разделения компонентов смеси

– эф- фект «молекулярного сита». Стационарная фаза пред-

ставляет собой пористый материал: органические поли-

меры с 3D – сетчатой структурой. Обязательное условие – стационарная и подвижная фазы должны быть химически

и биологически нейтральны по отношению к компонентам разделямой смеси.

Стационарная фаза – вода, прочно связанная с пов ностью гидрофильных волокон органических полиме образующих 3D – сетчатую структуру (гранулу). Эта образует гидратную оболочку на поверхности волоко Подвижная фаза – вода или буфер, которые заполн пространство вне гранул, эта фаза постоянно движе заданной скоростью.

Т.о. вода (буфер) – и стационарная, и подвижная фаз

Связанная вода (в составе гидратной оболочки волок никогда не перемешивается с водой подвижной фаз

Фактор, определяющий возможность разделения ко нентов смеси – соотношение размеров молекул комп тов смеси и размера пор, через которые внутренний объем гранул сообщается с внешним пространством

Материалы для стационарной фазы:

-гель на основе декстрана («Sephadex»)

-гель на основе агарозы («Sepharose»)

-гель полиакриламидный (ПААГ), «Биогель» и др.

Достоинства гель-хроматографии:

- эффективность разделения смеси белков не зависит от

рН, То, ионной силы буфера, химического состава буфе-

ра и др. условий

- отсутствие адсорбции компонентов смеси на

Применение:

волокнах- высокая степень разделения и очистки белков и стационарной фазы и взаимодействия эл. нукле- зарядов.

иновых кислот с сохранением их нативных свойств

-концентрирование растворов белков

-точное определение молекулярной массы белков

3. Адсорбционная хроматография

Стационарная фаза – твердый сорбент (может обла пористой поверхностью): кремневая кислота, окиси Mg, карбонаты Сa и Zn, силикагель и др.

Подвижная фаза – как правило, различные орг. рас рители.

При адсорбции, молекулы из разделяемой см притягиваются к поверхности адсорбента за их химического сродства. Это не случай элек статического притяжения к поверхности адс бента молекул, имеющих с ним разноименны заряды.

Фактор, определяющий возможность разделения ко нентов смеси – различия в степени адсорбции компо тов смеси на поверхности сорбента и их растворимо в подвижной фазе. Если стационарная фаза порист то в процессе разделения компонентов смеси участв также процессы диффузии (черты гель-хроматограф

Концентрация вещества в растворе

Разделение проводят в стеклянных колонках которые, в зависимости от целей, могут име разное соотношение высоты и внутреннего д метра («геометрия хроматографической ко- лонки»):

1.Для очистки белков (макромолекул) от ни молекулярных примесей требуется H/D <

2.Для разделения смеси белков (хроматогра ческое фракционирование) требуется H/D = 100 : 1

Разделение: стерины, белки, аминокислоты пептиды, углеводы, нуклеиновые кислоты и

4. Ионообменная хроматография

Обязательное условие для разделения компонентов с с помощью данного вида хроматографии – наличие у электрического заряда. Удержание отдельных компо смеси на стационарной фазе идет благодаря электро тическому притяжению разноименных зарядов.

Стационарная фаза – твердый носитель (3D- сетчатая матрица: декстран, целлюлоза и др.), содержащий на по-

верхности заряженные группы – ионогенные группы.

Если матрица несет –q, то это катионообменник ( R-

SO3-);

если имеет +q, то это анионообменник: R-N+(CH3)3.

Примеры ионообменников:

-на основе декстрана «сефадекс», которые быть катионо- и анионоообменниками.

-на основе целлюлозы: катионообменник – к боксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза); ани обменник – диэтиламиноэтил целлюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза).

Разделение проводят в стеклянных колонка

Разделение: белки, аминокислоты, сахара, нуклеотиды и др. молекулы, способные в водном растворе нести электрические заря